中国食管癌高发区无症状人群液体活检技术筛查早期食管癌和高危人群的多中心应用研究

孟超龙，赵学科，崔晓宾，程 锟，胡守佳，王盼盼，钟 侃，胡景峰，宋 昕，王 伟，李欣然，杨苗苗，徐瑞华，魏梦霞，韩文莉，雷玲玲，姚品芳，熊 飞，伊力亚尔·夏合丁，李 锋，曹维克，王立东

(1.郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室、省部共建食管癌防治国家重点实验室，河南 郑州450052；2. 新疆石河子大学基础医学院病理学教研室，新疆 石河子 832003；3. 湖北省肿瘤医院研究所，湖北 武汉 430079；4. 湖北省肿瘤医院胸外科，湖北 武汉 430079；5. 新疆医科大学第一附属医院胸外科，新疆 乌鲁木齐 830054；6. 淮安市第一人民医院检验科，江苏 淮安 223300)

湖北钟祥、新疆乌鲁木齐、江苏南京是食管癌发病率和死亡率较高的3个地区。目前，食管癌依然是3个地区肿瘤相关主要死亡原因。早期食管癌患者症状并不典型,随着病情的发展可逐渐出现吞咽困难、食管内异物感及胸骨后烧灼样疼痛等症状[1]，首次就诊的患者90%左右已经处于中晚期[2-3]。本课题组以往研究[4]表明：使用液体活检技术从无症状人群中确定高危人群，再进行色素内镜检查是目前实现食管癌早期发现的最佳技术。多种肿瘤相关抗原可以在食管癌组织中表达，并且可以在食管癌患者血液中检测到相应的自身抗体，不同的抗体表达的量有所不同[5]。本研究团队使用液体活检技术检测食管癌高发区无症状人群血清中肿瘤相关抗原自身抗体，然后根据液体活检技术检测结果，进一步做色素内镜检查，探索自身抗体联合检测在食管癌早期发现和高危人群筛查中的意义，并建立相应的能用于大规模食管癌高危人群筛查的液体活检技术。

1 资料与方法

1.1 研究对象第1组人群来自郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室血清样本，其中正常人血清245例作为对照组，早期食管癌患者血清245例作为早期食管癌组。245例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。245例正常人中，男121例、女124例，年龄35～70(52.07±10.21)岁。245例早期食管癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+Ⅰ期)食管癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。245例食管癌患者中，男135例、女110例，年龄35～70(59.45±6.99)岁。

第2组人群来自于豫北食管癌高发区某镇流行病学调查，共纳入自愿接受流行病学调查、液体活检和色素内镜检查的无症状人群1 755例，男869例、女886例，年龄35～70(51.91±10.33)岁。

第3组人群来自于湖北钟祥、新疆乌鲁木齐、江苏南京食管癌大规模筛查，共纳入自愿配合食管癌筛查的无症状人群6 325例，其中男3 132例、女3 193例，年龄35～70(51.96±10.30)岁。对其进行液体活检，5种血清肿瘤相关抗原自身抗体有至少1种阳性者再进行色素内镜检查。

1.2 方法

1.2.1 检查试剂和方法 对3组研究对象分别抽血，每例均取空腹静脉血5 mL至离心管中，室温静置30 min，然后离心(2 000 r/min)20 min，吸取上层血清进行分装，每管100 μL，用液氮进行保存，最后储存到-80 ℃冰箱内备用。

提取和纯化的乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)来自美国Scripps研究所。

采用本研究团队以往建立的间接酶联免疫吸附试验方法对所取标本进行上述5种血清肿瘤相关抗原自身抗体检测[6-7]，各包被抗原的稀释终浓度为0.5 μg/μL，血样稀释浓度为150，稀释浓度为15 000的抗人IgG用辣根过氧化物酶标记。在酶联免疫吸附试验板孔中加入用包被稀释液稀释过的抗原100 μL/孔，4 ℃过夜(24 h以上)。加入稀释后的患者血清100 μL/孔,每个样品至少要做2次检查，在37 ℃条件下孵育。已知阳性血清为阳性对照，包被缓冲液为阴性对照。加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 100 mL/孔, 在37 ℃条件下孵育。加入四甲基联苯胺-过氧化氢尿素显色液，100 μL/孔，置于37 ℃条件下避光反应，当阳性对照出现比较明显的颜色变化后, 每孔加入终止液50 μL终止反应，最后在酶联免疫吸附试验读数仪上读取450 nm波长处光密度值。

1.2.2 血清学结果判定 采用美国Scripps研究所制定的判定方法确定截断值，读数在此截断值以上的为阳性，否则为阴性[3,8]。

1.2.3 色素内镜检查 对液体活检技术检测5种血清肿瘤相关抗原自身抗体有至少1种阳性者和大致相应数量阴性者进行色素内镜检查，用常规方法在食管中取活检组织，并在肉眼可见的病变处随机取活检组织，必要时进行染色，在食管不染区和贲门染区取材，所有的活检组织全部快速置于体积分数85%乙醇内固定[9-11]。

1.2.4 病理组织学检查 对色素内镜下夹取的食管活检组织，采用体积分数85%乙醇固定，常规脱水后用石蜡包埋，每张切片的厚度为5 μm，进行HE染色，然后进行组织病理学诊断。

1.3 统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学分析，计数资料用百分数表示，比较用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 早期食管癌组和对照组研究对象血清肿瘤相关抗原自身抗体表达比较早期食管癌组BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP等5种血清肿瘤相关抗原自身抗体阳性率均高于对照组，差异均有统计学意义(χ2=6.053，P<0.001；χ2=5.833，P<0.001；χ2=4.200，P<0.001；χ2=4.374，P<0.001；χ2=4.992，P<0.001)。随着自身抗体组合数目的增加，早期食管癌诊断的敏感性也随之增加，5种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测的敏感性高达86.94%；虽然随着抗体数目的增加，特异性逐渐降低，但5种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测的特异性仍然能够达到82.45%。结果提示，5种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测既能保持较高的特异性，又能提高诊断的敏感性。见表1、2。

表1 早期食管癌组和对照组研究对象血清肿瘤相关抗原自身抗体表达比较 n(%)

表2 不同肿瘤相关抗原自身抗体联合检测对食管癌的诊断效能 n(%)

2.2 小规模人群验证在豫北食管癌高发区某镇进行流行病学调查，纳入自愿配合食管癌筛查的无症状人群1 755例，利用食管癌高危人群预警和早期发现的关键技术对其进行液体活检，并与色素内镜检查结果进行比较。1 755例无症状人群年龄、性别分布见表3，液体活检与色素内镜检查比较结果见表4。

表3 1 755例无症状人群年龄、性别分布 n(%)

表4 液体活检与色素内镜检查结果比较 n(%)

2.3 大规模人群验证结果在湖北钟祥、新疆乌鲁木齐、江苏南京进行流行病学调查，纳入自愿配合食管癌筛查的无症状人群6 325例，年龄、性别分布见表5。利用食管癌高危人群预警和早期发现的关键技术对其进行液体活检，结果发现阳性(高危)人群1 018例，阴性(正常)人群5 307例。1 018例液体活检阳性人群进行色素内镜检查，结果发现正常567例(8.96%)、癌前病变286例(4.52%)、食管癌[149例(2.36%)，其中早期食管癌130例(2.06%)、晚期食管癌19例(0.30%)]、其他上消化道肿瘤16例(0.25%)。

表5 6 325例无症状人群年龄、性别分布 n(%)

3 讨论

食管癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段、复杂的演进过程[12]，但其明确的发病因素及分子机制仍然不是十分清楚[6]。同时，高发区食管癌的发病率和死亡率仍然比较高，患者就诊时间相对过晚使治疗效果并不理想，因此，食管癌的早发现、早诊断和早治疗非常关键。本研究分别对BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP等5种血清肿瘤相关抗原自身抗体进行检测，并对其进行最优组合，结果提示，BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP的组合可用于早期食管癌诊断和高危人群筛查。

本研究团队在湖北钟祥、新疆乌鲁木齐、江苏南京开展了多中心应用性研究，用血清肿瘤相关抗原自身抗体联合检测食管癌高发区无症状人群，筛查出至少1种自身抗体阳性人群，然后做色素内镜检查，结果表明，本实验室团队建立的食管癌高危人群预警和早期发现的关键技术应用后可区分早期食管癌和癌前病变。因此，在食管癌高发区应用自身抗体联合检测液体活检技术对筛查早期食管癌和高危人群有一定实用价值。

与传统色素内镜筛查技术相比，本实验室团队建立的食管癌高危人群预警和早期发现的关键技术不仅实现了上消化道恶性肿瘤的精准筛查,更明确了癌前病变恶性转归人群监测范围。明显减轻财政负担和患者的精神压力，且该液体活检技术具有成本低、无创和精准等特点，值得推广应用。