正交试验优选鸡血藤总黄酮提取工艺

王有娣， 钟丽娟， 徐娟娟， 许洁涵， 张焕欣， 林 娴， 陈心想， 姚小丽

（中山大学新华学院药学院，广东广州 510520）

鸡血藤为豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤茎，其对控制机体正常的新陈代谢起着重要作用，也可在一定程度上维护动物体内生物的平衡，促进动物体健康、防治疾病，所以鸡血藤目前已作为饲料添加剂使用。鸡血藤化学成分复杂多样，含有蛋白质、多种维生素和血质红色素、矿物质，以及多种重要的黄酮类化合物（刘晓艳等，2020；Keiko Inami等，2019；廖辉等，2017；陈乾平等，2016）。黄酮类化合物是普遍存在于植物中的一类生物活性成分，具有抗氧化、增强免疫、抗感染、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种生物活性；另外，黄酮类化合物对动物的生产性能有明显的促进作用，其作为饲料添加剂有助于动物的健康育肥和免疫力的提高，同时对于提高肉类品质具有重要意义，因此受到广泛关注 （杨恒强等，2020；要瑞丽等，2014；冯香安等，2011）。目前 关于鸡血藤的生物活性研究已有不少 （曹斌等，2017；许晴等，2016），但对其黄酮类成分提取工艺的研究却不多，因此，本试验在参考郑洁旋等（2016）植物总黄酮的提取工艺研究方法上，以单因素考察为试验基础，再对乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比四个因素进行正交试验，研究鸡血藤总黄酮的最佳提取工艺，为进一步开发利用鸡血藤提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 组织捣碎机（FW-17型号）；六联索氏提取器（SOX606型，海能）；紫外可见分光光度计 （UV-2201，日本岛津公司）；电子天平（AUY120型，日本岛津公司）。

鸡血藤药材采购于岭南中药饮片有限公司（粉碎备用）；芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所（纯度为98%）；无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸等试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 芦丁对照品母液：精密称量芦丁标准品9.3 mg，加少量50%乙醇溶解，超声（100 Hz，30 min），移液至 100 mL 的容量瓶，用50%乙醇定容至刻度。精密称取芦丁对照品母液 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置 25 mL 容量瓶，分别加入5%亚硝酸钠1 mL，静置6 min，加入 10% 的硝酸铝 1 mL，静置6 min，加入 1 mol／L的氢氧化钠溶液10 mL，用50%乙醇定容至标线，摇匀，静置15 min，用紫外可见分光光度计（λ=510 nm）测定吸光度值，以吸光度为纵坐标（y），以芦丁浓度为横坐标（x）进行线性回归，绘制芦丁标准曲线。

1.2.2 鸡血藤总黄酮提取率的测定 根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的质量浓度，通过以下公式计算提取率。

式中：C为鸡血藤总黄酮的质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为样品液体积，mL；M为样品质量，g。

1.2.3 鸡血藤总黄酮单因素试验 以鸡血藤总黄酮的提取率为指标，乙醇浓度 （40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）和料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1：40）为 考察因素进行单因素试验。

1.2.4 正交试验 以单因素试验考察为基础，用乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、料液比（D）为影响因素，采用四因素三水平设计正交试验方案，以鸡血藤总黄酮的提取率为衡量指标。

1.3 数据分析 采用Excel 2016软件对标准曲线数据和单因素试验数据进行统计、分析。采用正交设计助手II v3.1软件对正交试验数据进行方差统计等分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 以吸光度为纵坐标（y），以芦丁浓度为横坐标（x）进行线性回归，得回归方程为y=12.573x-0.0007，线性相关系数R2=0.9991，表明芦丁在检测浓度范围内线性良好，芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对鸡血藤总黄酮提取率的影响乙醇是一种绿色的中药材提取溶剂，适用于提取一些极性较大的成分，但如果乙醇的浓度过小容易导致一些水溶性的杂质溶出，如果乙醇的浓度过大则容易导致色素等一些小极性杂质溶出。鸡血藤总黄酮成分主要染料木素、刺芒柄花素等一些多羟基取代的成分，如果乙醇浓度过高或者过低均会影响其黄酮成分的提取率，故必须选择合适的乙醇提取液浓度。乙醇浓度对鸡血藤总黄酮提取率的影响结果见图2，随着乙醇体积分数的增大，总黄酮提取率逐渐增大，当乙醇体积分数为50%时出现最高点，此时鸡血藤总黄酮得率最高，然后趋势逐渐下降。

图2 乙醇浓度对提取率的影响

2.2.2 提取时间对鸡血藤总黄酮提取率的影响提取过程的完成需要一定的时间，当有效成分扩散达到平衡状态时，该中药材的提取过程即已完成，长时间进行提取，高分子杂质溶出增加，并可能导致已溶出的有效成分降解。提取时间对鸡血藤总黄酮提取率的试验结果见图3，随着提取时间的增加，总黄酮提取率逐渐增大，当提取时间为2 h时出现最高点，此时鸡血藤总黄酮得率最高，随后提取率下降。

图3 提取时间对提取率的影响

2.2.3 提取温度对鸡血藤总黄酮提取率的影响一般而言，升高温度可以加快中药材有效物质的溶出，但如果温度太高，高分子杂质增加且容易导致热敏性的成分降解。提取温度对鸡血藤总黄酮提取率的试验结果见图4，随着提取温度的增加，总黄酮提取率逐渐增大，当提取温度为70℃时出现最高点，此时鸡血藤总黄酮得率最高，然后提取率趋势缓慢下降。

图4 提取温度对提取率的影响

2.2.4 料液比对鸡血藤总黄酮提取率的影响 料液比对鸡血藤总黄酮提取率的影响试验结果见图5，随着料液比的增大，总黄酮的提取率也逐渐增大，当提取率料液比为1：20时出现最高点，此时鸡血藤总黄酮得率最高，之后提取率呈下降趋势。

图5 料液比对提取率的影响

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交试验提取方案的优化 以单因素试验考察结果为基础，进一步得出提取工艺的最佳条件，用乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为影响因素，采用四因素三水平设计正交试验方案，分析总黄酮提取率。正交试验因素和水平如表1所示。

表1 正交试验因素和水平

2.3.2 正交试验和方差分析结果 采用L9（34）进行正交试验，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。从正交试验直观分析结果可以看出，各因素对鸡血藤总黄酮提取率的影响程度不同，四个因素对提取率的影响由大到小依次为提取时间＞提取温度＞乙醇浓度＞料液比。从方差分析结果可以看出，四个因素对提取率均无显著性影响。结合直观分析和方差分析结果，筛选出鸡血藤总黄酮的最优提取方案为B3A3C2D1，即称取鸡血藤粉末，用20倍量的60%乙醇作提取剂，70℃加热回流提取2.5 h。

表2 L9(34)正交试验结果（直观分析）

表3 正交试验方差分析结果

2.4 提取工艺的验证 根据以上正交试验的结果，在最优的提取工艺B3A3C2D1条件下进行三次平行试验，通过鸡血藤总黄酮的提取率验证最优提取工艺的可行性和合理性。试验结果显示，用20倍量的60%乙醇作提取剂，70℃加热回流提取2.5 h的提取方案提取鸡血藤总黄酮，提取率为34.90%。

3 结论

本试验结果表明，四个影响因素中提取时间对提取率影响最大，其次是提取温度和乙醇浓度，对提取率影响最小的是液料比。在单因素试验得出各因素范围的基础上，综合考虑主次水平，以取最好水平为主要因素，再考虑次要因素时间、成本等，由此得出鸡血藤总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇提取液浓度60%、提取温度70℃、提取时间2.5 d、提取料液比1：20，在该条件下鸡血藤总黄酮的提取率可达34.90%。