免疫组化双染SF-1/DOG1对不育症患者睾丸活检细胞的辅助诊断

武良美，袁 菊，王 璇，巩 雪，马恒辉，陆珍凤，陈 辉

睾丸活检病理学诊断是诊断不育症患者睾丸中精子发生状态的金标准，其主要临床意义是判断梗阻性无精子症或非梗阻性无精子症[1]。前者是指睾丸能够产生精子，但输精管道阻塞，精子无法顺利排出，可通过实行外科手术解除梗阻；后者是指睾丸不能产生或产生少量的不成熟的精子，必须通过现代辅助生殖技术，改善患者的生殖水平[2-3]。本文探讨常规福尔马林固定的睾丸活检细胞，经SF-1/DOG1免疫组化双染与HE染色比较，让病理医师对睾丸生殖细胞成熟阶段的形态学特征有了更为直观的认识，从而对不育症患者组织学分类、治疗措施的选择和预后提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2014～2018年中国人民解放军东部战区总医院病理科及江苏省南京市浦口区中心医院筛选的28例无精子症男性睾丸活检标本。患者有关临床参数和精子回收率的信息通过查看电子病历获得。

1.2 组织切片制备及HE染色活检组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3 μm厚连续切片，行常规HE染色。

1.3 组织学分型依据阿克曼外科病理学睾丸生殖病理(第10版)的诊断标准，按形态学分为5种组织学类型：(1)生精小管广泛玻璃样变，定义为包括广泛硬化的所有生精小管，没有可识别的生殖细胞或支持细胞；(2)唯支持细胞综合症，指生精小管中没有任何成熟程度的生殖细胞，只有支持细胞存在；(3)成熟迟滞型，以存在生殖细胞为特征，但未成熟(即没有可识别的细长精子细胞)；(4)精子发生低下，定义为活检组织有精子发生，但程度有所降低(即生殖细胞成熟进展到晚期精子细胞，生精小管数量减少)；(5)生精功能正常。

1.4 免疫组化采用免疫组化鸡尾酒双染法染色，DOG1抗体(1 ∶25稀释)购自Cell Marque公司；SF-1抗体(1 ∶50稀释)购自R&D公司；免疫组化双染检测试剂盒购自北京中杉金桥公司。实验步骤：(1)3 μm厚石蜡切片置于二甲苯和乙醇中脱蜡水洗；(2)高压锅中加入免疫组化抗原修复液，购自福州迈新公司(柠檬酸法)，高温高压修复5 min；(3)滴加免疫双染检测试剂盒试剂1(内源性过氧化物酶阻断剂)50 μL，室温孵育10 min，水洗画圈，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2 min×3次；(4)滴加DOG1抗体试剂50 μL，37 ℃孵育100 min，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2 min×3次；(5)滴加SF-1抗体试剂50 μL，37 ℃孵育100 min，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2 min×3次；(6)滴加50 μL免疫双染检测试剂盒试剂2(即用型组合二抗，即HRP标记抗兔IgG+AP抗小鼠HRP)，37 ℃孵育30 min，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2 min×3次；(7)滴加50 μL免疫双染检测试剂盒试剂3，室温孵育10～15 min，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2 min×3次；(8)滴加50 μL免疫双染检测试剂盒试剂4，室温孵育5～10 min，自来水冲洗；(9)苏木精染色液室温染色0.5～1 min，自来水冲洗干净，返蓝晾干，切勿乙醇脱水；(10)透明、中性树胶封固。

2 结果

2.1 临床特征28例男性不育症患者，平均年龄28岁(范围24～39岁)。活检前精液分析显示23例(82%)精子计数为0(无精子症)，其余5例(18%)为极罕见精子(少精子症)。原发性不育症23例(82%)，继发性不育5例(18%)。临床病史包括克氏综合征6例(21%)，精索静脉曲张7例(25%)，伴双侧隐睾史的促性腺功能低下2例(7%)，双侧附睾梗阻3例(11%)，既往睾丸炎2例(7%)，既往附睾炎3例(11%)。

2.2 病理检查组织学诊断包含3例(11%)精子生成正常患者，7例(25%)精子生成低下患者，3例(11%)精原细胞成熟迟滞患者，14例(50%)唯支持细胞综合征患者和1例(4%)伴广泛生精小管玻璃样变患者。所有活检组织生精小管细胞按免疫组化双染结果分为2种(表1)。(1)SF-1+/DOG1+：在正常精子发生(图1)、精子生成不足(图2)和成熟迟缓标本中(图3)均呈双重阳性；(2)SF-1+/DOG1-：在唯支持细胞综合征中DOG1阴性，仅SF-1阳性(图4)。根据免疫组化双染结果显示：在正常精子发生、精子生成不足和成熟迟缓这些病例中DOG1的阳性程度是由高到低的。

表1 不育症的形态学特征及免疫表型

①A①B②A②B③A③B④A④B

3 讨论

全世界不孕不育症患者有6 000万～8 000万对夫妇，其中40%～50%的不孕是由男性因素造成的[4]。梗阻性无精子症有时可以通过手术得到缓解，而在非梗阻性无精子症患者中，如果没有辅助生殖技术生育能力通常无法实现。从非梗阻性无精子症患者睾丸成功取出精子的可能性取决于活检的相关组织学类型。

尽管睾丸活检很重要，但是病理医师的诊断仍然存在显著差异性，比如Cooperberg等[5]在重新检查113例睾丸活检切片中发现，原始诊断和重新检查时的诊断之间的一致性仅为中等。因此，病理医师对精子形成的质量和程度的评估，依赖于鲜明的细胞核着色和生精细胞结构的完整性这两个形态学特征。遗憾的是，10%中性福尔马林固定虽然可以更方便地固定标本，但睾丸活检组织细胞的核着色相对较差，存在细胞收缩，细胞结构脱落的问题，因此仅依靠睾丸活检的常规HE染色，病理医师很难评估生殖细胞的成熟程度。Bouin固定液对细胞核着色鲜明，并保持精小管结构的完整性等优点，但是它会造成毒性和处理问题，因此，国内不常用[6-8]。

DOG1抗体最近被发现在生殖细胞中表达，特别是精原细胞和精子细胞。Osman等[9]研究发现虽然DOG1在精原细胞瘤中不着色，但它在正常输精管中的精母细胞和精子细胞中表达。另Salama等[10]在2015年美国和加拿大病理学年会上发表的将DOG1免疫组化染色技术应用于40例不育症睾丸活检，发现精母细胞和精子细胞染色。利用Salama等的发现，结合SF-1在所有的激素样细胞组织中的表达作用(特别是肾上腺皮质、睾丸支持细胞、间质细胞)[11]，本实验设计了SF-1/DOG1免疫组化双染法，用以鉴定患者的生殖细胞和支持细胞的形态学特征。

综上所述，SF-1/DOG1免疫组化双染对比常规HE染色可以更直观的帮助病理医师解释福尔马林固定睾丸活检组织的形态学特征，并且可以从免疫组化双染结果中获益，帮助不育症患者的分类，从而使患者和临床医师能够更好地了解辅助生殖技术的后续使用情况。