肺腺癌组织中lncRNA LRRC77P的表达及对肺腺癌细胞生物学特性的影响

王 娜，王 越，王梦鸽，曹小九，张智辉，张国俊

肺癌是最常见的呼吸系统恶性肿瘤，发病率和病死率均较高[1]。肺腺癌是肺癌最常见的病理分型之一，具有起病隐匿、早期症状不明显的特点，发现时多处于中晚期，5年生存率较低[2]。探讨肺腺癌发生、发展的分子机制对肺腺癌早期诊断和中晚期治疗具有重要临床意义。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)属于内源性非编码单链RNA分子，可在表观遗传学水平、转录水平、转录后水平等多个层次调控下游基因的表达，参与细胞分化、代谢、增殖、凋亡等基础生命活动[3]。近年研究表明，lncRNA在胃癌、肝癌、肾癌等多种肿瘤中表达上升或降低，与肿瘤的发生和进展相关[4-5]。越来越多的lncRNA被证实可调控肺腺癌细胞的生长和转移，其表达水平与肺腺癌病理分期和预后相关[6-7]。本组前期研究显示lncRNA在肺腺癌组织中低表达，提示LRRC77P可能是肺腺癌发生的相关因子。LRRC77P是由434个核苷酸组成的lncRNA，目前未见相关的文献报道。本文检测LRRC77P在肺腺癌组织和细胞系中的表达，观察其对肺腺癌细胞生物学特性的影响，旨在探讨LRRC77P在肺腺癌细胞中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料收集2017年3月～2019年7月郑州大学第一附属医院收治的67例肺腺癌手术切除肺腺癌组织和对应癌旁组织，术后立即置于液氮中保存，所有标本均经病理活检证实为肺腺癌或癌旁组织。其中男性39例，女性28例，平均年龄(61.32±8.41)岁。病理分期：Ⅰb期29例、Ⅱa期23例、Ⅱb期15例、Ⅲa期10例。本实验经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞与主要试剂正常肺泡上皮细胞(HPAEpiC)和肺腺癌细胞系(H1299、H1975、H1650、HCC827、A549)购自中国科学院上海细胞生物所。阴性对照慢病毒和载有LRRC77P序列的慢病毒购自上海吉玛公司。DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基及胎牛血清购自美国HyClone公司。Transwell小室购自美国康宁公司。荧光实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)试剂盒购自大连宝生物公司。引物购自武汉擎科生物公司。四甲基偶氮唑盐(methyl thiazol tetrazolium, MTT)试剂盒、二甲基亚砜购自武汉华美生物公司。一抗β-tubulin、PCDH10、p-PI3K、p-AKT、NF-κB、GSK-3和二抗购自美国CST公司。增强型化学发光试剂(ECL)显影液购自美国Thermo公司。

1.3 细胞培养和慢病毒感染H1299、H1975、H1650、HCC827细胞培养在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，A549、HPAEpiC细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的H1299细胞接种于6孔板，细胞密度达60%，按照病毒滴度(MOI)=30，将阴性对照慢病毒和载有LRRC77P序列的慢病毒分别感染H1299细胞，分别命名为对照组和实验组。慢病毒转染12 h后，更换新鲜RPMI-1640培养基。

1.4 qRT-PCR根据TRIzol试剂盒说明书，提取肺腺癌组织和细胞系的总RNA，逆转录为cDNA。根据qRT-PCR试剂盒说明书设置反应条件：95 ℃预变性5 min，62 ℃ 35 s、72 ℃ 35 s，合计35个循环。以U6为内参检测miR-182-5p的表达，以GAPDH为内参检测LRRC77P和PCDH10 mRNA的表达。采用2-ΔΔCt方法分析基因表达量。U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-182-5p上游引物5′-GGAAACCGTTACCATCTTG-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；GAPDH上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；LRRC77P上游引物5′-TTCGAGTTGAAACCCTCTGG-3′，下游引物5′-AAAGCTCACTCCACCTACGC-3′；PCDH10上游引物5′-TGGATGGTGGAAGGAGTCTTT-3′，下游引物5′-TTCAGCGATATTCCCCACGAA-3′。

1.5 MTT法检测细胞增殖能力取对数生长期的两组H1299细胞接种于96孔板，每组设4个复孔，每个复孔调整细胞密度为每毫升2×104个细胞。MTT法检测时，每孔加入15 μL MTT试剂，继续培养4 h后弃去培养基，每孔加入100 μL二甲基亚砜，充分振荡20 min。在酶标仪波长450 nm处检测每孔的光密度(optical density, OD)值；分别于接种后第1、2、3、4、5天进行MTT法检测，并绘制细胞生长曲线。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力取对数生长期的两组H1299细胞，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释至每毫升6×105个细胞，接种于6孔板中，置于培养箱培养。肺腺癌细胞密度达到90%时，弃去培养基，采用无菌200 μL枪头在每孔底部进行划痕。采用PBS缓冲培养液洗3次，每孔加入不含胎牛血清的培养基。采用倒置显微镜测量初始划痕宽度S1，置于培养箱培养24 h后，拍照测量划痕宽度S2。实验重复4次，细胞迁移率=(S1-S2)/S1×100%。

1.7 生物信息学预测LRRC77P的下游基因采用LncBase Predicted v.2数据库预测LRRC77P互补结合的miRNA，采用microRNA.org数据库预测miRNA互补结合的基因。

1.8 Western blot实验检测PCDH10蛋白的表达收集各组H1299细胞，加入细胞裂解液，提取各组细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白取40 μg进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，并转移到聚偏氟乙烯膜上。在常温下，采用5%脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗PCDH10(1 ∶2 000稀释)、p-PI3K(1 ∶2 000稀释)、p-AKT(1 ∶2 000稀释)、NF-κB(1 ∶1 000稀释)、β-tubulin(1 ∶1 000稀释)及GSK-3(1 ∶2 000稀释)，在4 ℃下孵育过夜。常温下加入二抗孵育2 h。添加ECL发光试剂曝光、显影，以β-tubulin作为内参蛋白。

2 结果

2.1 肺腺癌组织和细胞系中LRRC77P的表达qRT-PCR检测结果显示，LRRC77P在67例肺腺癌组织和癌旁组织中的表达量分别为1.04±0.08和3.86±0.19。与癌旁组织相比，肺腺癌组织中LRRC77P的表达显著减少(t=49.28，P<0.01，图1)。LRRC77P在正常肺泡上皮细胞HPAEpiC和肺腺癌细胞系H1299、H1975、H1650、HCC827、A549中的表达量分别为1.00±0.01、0.12±0.03、0.66±0.06、0.51±0.03、0.71±0.03和0.29±0.02。与正常肺泡上皮细胞相比，LRRC77P在肺腺癌细胞系中的表达显著减少(P<0.01)，其中在H1299细胞中表达最低(P<0.01，图2)。

2.2 感染载有LRRC77P序列慢病毒高表达H1299细胞中LRRC77P的表达qRT-PCR检测结果显示，对照组和实验组H1299细胞中LRRC77P的表达量分别为1.03±0.14和9.89±1.29。与对照组相比，实验组H1299细胞中LRRC77P的表达量显著上升(P<0.01，图3)。

图1 肺腺癌组织和癌旁组织中LRRC77P的表达

图2 正常肺泡上皮细胞和肺腺癌细胞系中LRRC77P的表达

图3 对照组和实验组H1299细胞中LRRC77P的表达

2.3 高表达LRRC77P抑制H1299细胞的增殖能力MTT检测显示，第1天两组细胞增殖能力差异无显著性(P>0.05)，第2、3、4、5天高表达LRRC77P实验组H1299细胞的OD值显著少于对照组(P<0.05)，表明高表达LRRC77P可抑制H1299细胞的增殖能力(图4)。

图4 高表达LRRC77P对H1299细胞增殖能力的影响

2.4 高表达LRRC77P抑制H1299细胞的迁移能力细胞划痕实验结果显示，对照组和实验组H1299细胞的迁移率分别为(66.34±6.50)%和(26.98±5.92)%，实验组细胞的迁移率显著低于对照组(P<0.01)，表明高表达LRRC77P可抑制H1299细胞的迁移能力(图5)。

图5 高表达LRRC77P对H1299细胞迁移能力的影响

2.5 生物信息学预测LRRC77P的下游基因采用LncBase Predicted v.2数据库预测显示，LRRC77P可互补结合miR-182-5p；采用microRNA.org数据库预测显示，miR-182-5p可互补结合PCDH10 mRNA(图6)。

图6 生物信息学预测LRRC77P的下游基因

2.6 高表达LRRC77P对H1299细胞中miR-182-5p和PCDH10 mRNA表达的影响qRT-PCR检测显示，对照组和实验组H1299细胞中miR-182-5p表达分别为1.01±0.10和0.26±0.05，实验组miR-182-5p的表达显著低于对照组(P<0.01)。对照组和实验组H1299细胞中PCDH10 mRNA表达分别为1.03±0.14和6.19±0.54，实验组PCDH10 mRNA的表达显著高于对照组(P<0.01，图7)，表明高表达LRRC77P可抑制miR-182-5p的表达，促进PCDH10 mRNA的表达。

图7 高表达LRRC77P对H1299细胞中miR-182-5p表达的影响

2.7 高表达LRRC77P对PCDH10蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白的影响Western blot检测显示，高表达LRRC77P后，PCDH10蛋白表达水平增加，PI3K/AKT信号通路如p-PI3K、p-AKT、NF-κB、GSK-3等蛋白的表达显著降低，表明PCDH10蛋白可抑制PI3K/AKT信号通路(图8)。

图8 高表达LRRC77P对H1299细胞中PCDH10和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

肺腺癌约占非小细胞肺癌的30%，其发病率呈逐年上升趋势，探讨肺腺癌发生、发展的机制，对肺腺癌的早期发现、治疗及预后至关重要[8-9]。lncRNA属于非编码RNA，长度超过200个核苷酸，通过调控下游基因的表达，影响肿瘤细胞生物学特性，在肿瘤的发病机制中发挥关键作用[10]。研究表明，lncRNA在肺腺癌组织中存在明显异常表达，可能成为肺腺癌早期诊断和中晚期治疗的重要靶点[11]。Zhao等[12]研究表明，lncRNA GMDS-AS1在肺腺癌组织和细胞系中表达明显降低，上调GMDS-AS1可通过抑制miR-96-5p表达，显著抑制肺腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡。Xu等[9]研究显示，lncRNA SNHG14在肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，过表达SNHG14可促进肺腺癌细胞增殖和侵袭，miR-613是SNHG14的下游靶基因。Xiao等[7]研究显示，lncRNA MALAT1在肺腺癌组织和细胞系中高表达，其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期显著相关，MALAT1主要通过抑制miR-429的表达，促进肺腺癌细胞的增殖和上皮-间充质转化。LRRC77P是一个尚未被报道的lncRNA，其在肺腺癌组织中的表达和作用机制有待分析。

本组结果显示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中LRRC77P的表达显著降低；与正常肺泡上皮细胞相比，肺腺癌细胞系中LRRC77P的表达显著降低，提示LRRC77P可能在肺腺癌的发生、发展过程中发挥重要作用。MTT法和细胞划痕实验显示，高表达LRRC77P可显著抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移能力，LRRC77P具有“抑癌基因”的功能。文献报道lncRNA的作用机制是通过竞争性互补结合miRNA，抑制miRNA的表达，从而间接抑制miRNA与其下游靶基因结合，促进下游靶基因的表达，即“竞争性内源RNA”作用[13]。本实验通过生物信息学预测显示，LRRC77P与miR-182-5p存在互补结合位点，miR-182-5p与PCDH10 mRNA之间存在互补结合位点。许多研究表明，miR-182-5p在肺腺癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤中的表达明显增加，可显著促进肿瘤细胞的生长和转移，miR-182-5p在肺腺癌中具有明显的“癌基因”作用[14-16]。本组结果表明，LRRC77P高表达后，miR-182-5p的表达明显降低。PCDH10基因位于人类染色体4q28.2，属于原钙黏蛋白家族，参与多种信号传导，对正常细胞的生长具有重要调控作用[17]。近年研究表明，PCDH10在肺腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤组织和细胞系中表达缺失，其与肿瘤细胞的过度增殖和转移密切相关，PCDH10低表达与肿瘤患者的不良预后相关，PCDH10在肺腺癌中发挥“抑癌基因”的作用[18-19]。qRT-PCR实验和Western blot实验结果显示，LRRC77P抑制miR-182-5p表达后，miR-182-5p下游基因PCDH10的表达明显增加。本组通过Western blot实验发现，H1299细胞中PCDH10蛋白表达上升后，PI3K/AKT信号通路相关蛋白如p-PI3K、p-AKT、NF-κB、GSK-3的表达显著降低，表明PI3K/AKT信号通路被抑制。PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞中被激活，可促进肿瘤细胞的过度增殖、迁移和侵袭[20-21]。上述实验结果提示，PCDH10蛋白可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥“抑癌基因”作用。

综上所述，本实验结果证明LRRC77P在肺腺癌组织和细胞系中呈低表达，高表达LRRC77P可抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移能力，其作用机制是LRRC77P通过“竞争性内源RNA作用”抑制miR-182-5p表达，间接促进PCDH10基因表达，阻滞PI3K/AKT信号通路。LRRC77P可能为肺腺癌的诊断和治疗新的候选靶基因。