不同切片厚度免疫组化标记Ki-67对惰性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤鉴别诊断的影响

吉佳乐，曾 晖，徐 丹，张 宇，林 爽，姚馨悦，何志承

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)是临床上最常见的淋巴系统恶性增殖性疾病，占整个淋巴瘤的90%以上，发病率和病死率位居恶性肿瘤前10位，且呈逐年增加的趋势[1]。目前临床上最常见的两种NHL分别是黏膜相关淋巴组织(mucosa associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)。Ki-67作为反应细胞增殖的重要标志物，其增殖指数(proliferation index, PI)高低可用于淋巴瘤分级鉴别诊断和预后指导，且Ki-67 PI值越高，患者预后越差[2]。在病理诊断工作中，通常采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)方法对Ki-67表达进行检测，其结果判读的准确性和稳定性至关重要。ASCO/CAP指南指出处理手术病理标本时，常规HE切片厚度应在4～5 μm，但对IHC切片厚度并没有给出明确标准。因此，本文选取了2、4、6、8 μm 4种切片厚度，对石蜡切片厚度与IHC染色中惰性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤组织Ki-67表达的影响进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集陆军军医大学第一附属医院2016年4月～2019年4月收治的淋巴瘤标本46例，其中MALT淋巴瘤18例，年龄46～78岁；DLBCL 28例，年龄27～77岁；所有患者术前均未进行任何治疗。

1.2 主要试剂及仪器Ki-67、OptiView DAB IHC Detection Kit购自美国Ventana公司；BenchMark XT全自动免疫组化染色机购自美国Ventana公司。

1.3 IHC标本经固定脱水后制成蜡块，并分别以2、4、6、8 μm厚度连续切片，60 ℃烤片备用。将制备好的切片放入BenchMark XT中，并设定相应程序进行染色：75 ℃烤片4 min；EZ Prep溶液76 ℃脱蜡4 min；Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修复液99 ℃修复30 min；抑制剂孵育45 min；加入Ki-67抗体60 μL，37 ℃孵育40 min；Reaction Buffer Concentrate(10×)缓冲液清洗5 min；37 ℃下二抗孵育8 min；DAB显色8 min，苏木精Ⅱ衬染12 min，返蓝液返蓝4 min。

1.4 IHC结果判定平均阳性染色面积百分比(average positive staining area percentage, APSAP)，可反映相应病例染色结果中的阳性细胞表达情况。姜洋等[3]研究表明：APSAP法分析IHC结果与人工计数分析方法的符合程度较高，可以作为衡量图片中阳性细胞百分数的方法。细胞核出现棕黄色颗粒为Ki-67阳性细胞，同一病例不同切片厚度随机选取8个(200×)相同视野。用Image J软件对每个标本检测结果中的阳性信号进行定量分析，得到相应的APSAP，与临床判读的实际阳性信号比例相比，误差约5%。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件对Ki-67不同表达组的APSAP数据进行统计学分析。采用t检验和Two-way ANOVA分别对组内和组间进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

为减少统计误差，本实验根据Ki-67判读结果，将MALT淋巴瘤分为低表达组(0≤Ki-67阳性率<20%)、较低表达组(20%≤Ki-67阳性率<40%)；将DLBCL分为中表达组(40%≤Ki-67阳性率<60%)、较高表达组(60%≤Ki-67阳性率<80%)、高表达组(Ki-67阳性率≥80%)。

2.1 切片厚度对染色强度的影响与2 μm厚度切片相比，4、6、8 μm厚度切片非特异性染色逐渐增多；6、8 μm厚度切片的组织结构与2、4 μm厚度切片相比出现一定程度组织脱落的现象(图1～3)。切片厚度与MALT淋巴瘤和DLBCL中Ki-67表达呈正相关，随着切片厚度的增加，病灶细胞核染色逐渐加深；当切片厚度在4 μm(±1 μm)时，组织结构相对完整，背景较为干净，更利于细胞计数。

①A①B①C①D②A②B②C②D③A③B③C③D

2.2 切片厚度对APSAP的影响Ki-67低、较低、中、较高及高表达组中，各切片厚度之间比较差异有显著性(P<0.05，表1)。比较各组中4种切片厚度的APSAP，结果提示组织切片越厚，其对应的APSAP值越高。比较5组Ki-67表达中各组间4种切片厚度对应的APSAP增长幅度和标准差可以发现：低表达组、较高及高表达组中厚度4 μm或6 μm切片APSAP对应的标准差分别低于2 μm和8 μm。综合分析结果显示：随着切片厚度的增加，Ki-67的APSAP也随之增加；组织切片厚度为4 μm或6 μm时，误差相对较小，可得到较为稳定可靠的检测结果。

表1 淋巴瘤组织不同切片厚度与Ki-67 APSAP的关系

3 讨论

NHL具有很强的异质性，根据肿瘤细胞增殖速度和临床特点，临床上主要将NHL分为惰性淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤和高度侵袭性淋巴瘤[4]。目前最常见的是MALT淋巴瘤和DLBCL，MALT淋巴瘤临床呈惰性表现；DLBCL有高度侵袭性且生长快速，若低度恶性的MALT淋巴瘤患者不及时治疗，恶化为DLBCL的机率较大[5]。活检穿刺组织如胃、肠等标本较小且部分含有坏死或纤维化的病变成分，仅靠单一的形态学分析难以对NHL进行准确的分型分级，需结合免疫组化标记对NHL进行联合诊断。Ki-67作为一种反映NHL细胞增殖活性的核表达蛋白，是MALT淋巴瘤和DLBCL鉴别诊断的关键指标，Ki-67 PI是低度恶性MALT转化为DLBCL的一种量化指标[6-7]。Broyde等[8]研究显示，Ki-67 PI为45%时，可作为区分惰性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤的临界值，侵袭性淋巴瘤恶性程度高于惰性淋巴瘤，且在高侵袭性淋巴瘤中Ki-67表达显著高于惰性淋巴瘤。Hashmi等[9]研究表明，Ki-67在MALT淋巴瘤中阳性细胞数一般不高于20%，在DLBCL中阳性细胞数一般不低于40%，有的呈过表达，阳性细胞数达90%以上。由于淋巴组织细胞丰富、间质少，切片过厚、染色深或有不着色的发白区等都会对病理医师诊断造成困扰。

文献报道，除标本类型、标本的固定及脱水、石蜡包埋、切片质量、抗原修复、一抗孵育、实验室水质等因素外，组织切片厚度对IHC结果也存在一定影响[10-11]。由于淋巴瘤肿瘤细胞胞核较大，如果切片较薄可能使部分抗原信号丢失，导致Ki-67检测受影响；而切片较厚则导致组织切片脱落，细胞计数过程中需不断调节显微镜微距，同时也不易区分核分界，容易造成细胞计数差异，导致结果误判。因此，需要探索出适宜的切片厚度，既能够保持组织细胞完整性，又能染色均匀，易于计数，得到比较准确稳定的计数结果，为临床病理诊断提供可靠依据。有研究报道组织切片间2 μm的差异对染色强度有一定程度的影响，导致IHC中标志物染色结果的错误判读。本实验对MALT淋巴瘤和DLBCL两种病变标本切片厚度分别选取2、4、6、8 μm四个变量进行分析，结果显示，随着切片厚度的增加，病变部位细胞核染色逐渐加深：当切片厚度为2 μm时，暴露细胞核层数相对较少，组织抗原暴露不充分，使IHC染色较浅且颜色对比不鲜明，对于阳性细胞较少的标本不好计数，同时病灶细胞核染色较浅；随着切片厚度的增加，暴露细胞核层数逐渐增多，个别病灶细胞可能出现重叠，所以细胞核染色逐渐加深；此外，随着切片厚度的增加，组织横断面细胞数增加，细胞核染色强度为3+的细胞数相对多于细胞核染色强度为2+和1+的细胞数，故组织总体染色强度加强。但是当切片厚度为8 μm时，细胞结构较厚，会出现非特异性染色，不利于细胞计数，并伴随有部分组织断裂和脱片。相比之下，4 μm和6 μm厚度切片组织结构清晰完整，没有明显的组织断裂和脱片，染色对比鲜明，可以很好的分辨并进行细胞计数。此外，本实验中Ki-67的APSAP也随着切片厚度的增加而增加，中～低表达组、中表达组、中～高表达组及高表达组中切片厚度2～8 μm的APSAP差值大于15%，导致计算出来的阳性细胞面积比例增大，使对应的阳性细胞数增多，从而也会导致Ki-67 PI出现较大差异。特别是对Ki-67增殖指数处于临界值45%的组织而言，如果APSAP偏高，可能导致Ki-67增殖指数大于45%；APSAP偏低，可能导致Ki-67增殖指数小于45%，这两种结果都可能误导医师对MALT淋巴瘤和DLBCL的鉴别诊断。所以，切片厚度过薄或过厚都会导致细胞计数误差较大，计数结果可能误导医师诊断。因此对于Ki-67增殖指数为45%左右的淋巴瘤组织，建议切片厚度在4～6 μm，该范围内的APSAP误差较小，可获得较为稳定可靠的结果，更为准确地辅助医师诊断。