重症中暑脑损伤患者神经元特异性烯醇化酶及脑活性肽100B蛋白的表达及意义

李冰，贾晔然，高伟，李惠萍，陶维华，张红璇

1南方科技大学第一附属医院/暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院呼吸与危重症医学科，深圳市呼吸疾病研究所，广东深圳 518020；2广东省人民医院/广东省医学科学院/广东省老年医学研究所老年医学科，广州 510080； 3广东省人民医院/广东省医学科学院/广东省老年医学研究所广东省干部体检中心，广州 510080

重症中暑(severe heatstroke)是机体暴露于高热环境或强体力劳动条件下，出现核心温度升高超过40 ℃及中枢神经系统功能受损症状(包括颅内高压、谵妄、惊厥甚至昏迷等)的重症疾病[1-2]。中枢神经系统损伤症状出现早且重，其损伤程度决定着患者的病情及预后[3]。神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、脑活性肽100B蛋白(S100B)是反映脑组织损伤程度和脑细胞功能障碍的敏感指标，可在多种脑功能损伤相关疾病中异常表达，并参与脑组织功能损伤相关疾病的发生与发展[4-5]。目前关于NSE、S100B在重症中暑脑损伤中的表达及其与中暑致脑功能损伤关系的研究较少。本研究探讨了NSE、S100B在重症中暑脑损伤临床诊治中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年5月－2019年7月于深圳市人民医院确诊并住院治疗的重症中暑脑损伤患者96例作为病例组，其中男48例，女48例，年龄17～75(41.4±3.2)岁。重症中暑诊断标准及严重程度分级严格参照我国《热射病规范化诊断与治疗专家共识》[6]。纳入标准：①入院后行颅脑CT及MRI检查排除脑出血、脑栓塞等器质性病变；②发病8h内入院；③既往无心、肺、肝、肾等脏器重大疾病史，无神经系统疾病和脑外伤病史。排除标准：①年龄≤16岁；②既往有脑血管病或癫病、恶性肿瘤、血液病、免疫系统疾病及内分泌系疾病病史。

选取同期于深圳市人民医院体检且各项指标均正常的健康志愿者96名作为对照组，其中男48名，女48名，年龄18～72(43.1±2.6)岁。对照组先行头部CT及MRI检查排除颅内疾病，经本人同意后留取外周静脉血及腰穿脑脊液标本。两组均为无民族间遗传干扰(与其他民族人通婚情况)、无血缘关系的汉族人，性别、年龄等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经深圳市人民医院医学伦理委员会批准，并获得受试对象的知情同意。

1.2 格拉斯哥昏迷量表(Glasgow coma scale，GCS)评分及分组 采用GCS评定量表从睁眼、语言、运动反应等3个方面进行评分。根据入院时GCS评分将病例组分为轻度损伤组(13～14分，伤后昏迷时间<20 min；n=32)、中度损伤组(9～12分，伤后昏迷时间20 min～6h；n=32)与重度损伤组(3～8分，伤后昏迷时间>6 h，或伤后24 h内意识情况恶化，再次昏迷超过6 h；n=32)。GCS评分越低，患者昏迷、意识障碍程度越重。

1.3 标本采集 病例组于入院时(0h)及入院后1、3、7 d采集EDTA抗凝空腹外周静脉血4 ml及脑脊液2 ml(行腰椎穿刺术经腰穿引流管采集)；对照组血液标本为体检时采集的空腹外周静脉血(4 ml)，脑脊液标本为经过检验科检测的正常脑脊液(2 ml)，离心分离预处理后，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.1 ELISA法检测血清、脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平 按照ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)说明书步骤进行检测，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度(OD)值，根据标准曲线计算NSE、S100B蛋白的表达水平。

1.3.2 Western blotting检测脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平 采用凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)提取脑脊液总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)进行定量；上样后，聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、漂洗封闭，加入兔抗鼠一抗(抗NSE、抗S100B，1:1000，武汉博士德生物工程有限公司)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1:2000，碧云天生物技术研究所)，显影，凝胶成像仪获取图像，用FluorChem 8900自动图像分析软件进行分析，以NSE、S100B与β-actin蛋白带的灰度峰比值为NSE、S100B蛋白的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用SNK-q检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。相关性分析采用Spearman秩相关法及Pearson法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平 Western bloはing及ELISA检测结果显示，病例组血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；随着脑损伤加重，病例组血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平逐渐增高，中度损伤组高于轻度损伤组，重度损伤组高于中度损伤组和轻度损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)；同等程度脑损伤患者脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平均高于血清(P<0.05，图1、表1)。

2.2 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者不同时间点血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平 Western blotting及ELISA检测结果显示，同一时间点，病例组血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平明显高于对照组(P<0.05)，中度损伤组明显高于轻度损伤组，重度损伤组明显高于中度损伤组和轻度损伤组(P<0.05)；总体比较，中度损伤组血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平明显高于轻度损伤组(P<0.05)，重度损伤组明显高于中度损伤组和轻度损伤组(P<0.05)。

图1 不同损伤程度组重症中暑脑损伤患者脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达(入院后7 d，Western blotting)Fig.1 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with different damage degree (7 days after admission, Western blotting)

表1 不同损伤程度组重症中暑脑损伤患者血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达(±s)Tab.1 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood and cerebrospinal fluid of subjects with diあerent damages degree (±s)

表1 不同损伤程度组重症中暑脑损伤患者血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达(±s)Tab.1 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood and cerebrospinal fluid of subjects with diあerent damages degree (±s)

NSE. 神经元特异性烯醇化酶；S100B. 脑活性肽100B蛋白；与对照组比较，(1)P<0.05；与轻度损伤组比较，(2)P<0.05；与中度损伤组比较，(3)P<0.05。

组别 NSE t P S100B t P血清 脑脊液 血清 脑脊液对照组(n=96) 3.12±0.15 5.36±1.45 3.63 <0.05 0.45±0.13 1.10±0.26 9.46 <0.05轻度损伤组(n=32) 15.46±4.72(1) 28.03±2.78(1) 2.52 <0.05 1.08±0.17(1) 1.66±0.25(1) 5.01 <0.05中度损伤组(n=32) 26.12±4.62(1)(2) 36.56±6.48(1)(2) 4.45 <0.05 1.39±0.56(1)(2) 1.97±0.13(1)(2) 13.03 <0.05重度损伤组(n=32) 41.87±5.59(1)(2)(3) 47.25±8.48(1)(2)(3) 7.16 <0.05 2.08±0.73(1)(2)(3) 2.87±0.57(1)(2)(3) 12.48 <0.05

不同时间点，病例组血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平均发生变化，NSE的表达呈升高趋势，3 d达峰值，然后进行性下降(P<0.05)；轻度损伤组S100B蛋白表达1 d达峰值，然后进行性下降(P<0.05)，中、重度损伤组S100B蛋白表达3 d达峰值，然后进行性下降(P<0.05，图2，表2、3)。

2.3 血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白表达与重症中暑脑损伤患者GCS评分的相关性 Spearman秩相关分析结果显示，血清NSE与血清S100B呈正相关(r=0.883，P<0.01)，与脑脊液S100B呈正相关(r=0.797，P<0.01)，与脑脊液NSE呈极强正相关(r=0.998，P<0.01)；脑脊液NSE与脑脊液S100B呈正相关(r=0.886，P<0.01)，与血清S100B呈正相关(r=0.824，P<0.01)；血清S100B与脑脊液S100B呈极强正相关(r=0.996，P<0.01)。即重症中暑脑损伤患者NSE与S100B蛋白的表达呈正相关。

Pearson相关分析结果显示，每个时间点的血清及脑脊液NSE、S100B蛋白表达与重症中暑脑损伤患者GCS评分均呈负相关，即GCS评分越低，NSE、S100B蛋白表达水平越高(P<0.05，表4)。

3 讨 论

图2 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者不同时间点脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达情况Fig.2 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with different damages degree of severe heatstrokeinduced brain injury

表2 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者不同时间点血清中NSE、S100B蛋白的表达(±s)Tab.2 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

表2 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者不同时间点血清中NSE、S100B蛋白的表达(±s)Tab.2 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

GCS. 格拉斯哥昏迷量表；NSE. 神经元特异性烯醇化酶；S100B. 脑活性肽100B蛋白；与对照组比较，(1)P<0.05；与轻度损伤组比较，(2)P<0.05；与中度损伤组比较，(3)P<0.05。

指标 对照组(n=96) 轻度损伤组(n=32) 中度损伤组(n=32) 重度损伤组(n=32)NSE 0 h 3.12±0.15 8.54±1.85(1) 20.32±5.37(1)(2) 32.50±4.16(1)(2)(3)1 d - 12.76±3.14(1) 23.56±3.34(1)(2) 40.64±7.40(1)(2)(3)3 d - 18.36±2.31(1) 30.48±4.36(1)(2) 46.54±7.16(1)(2)(3)7 d - 12.57±1.45(1) 25.86±5.24(1)(2) 42.14±8.05(1)(2)(3)S100B 0 h 0.45±0.13 0.98±0.16(1) 1.17±0.71(1)(2) 1.34±0.73(1)(2)(3)1 d - 1.38±0.25(1) 1.46±0.72(1)(2) 1.97±1.72(1)(2)(3)3 d - 1.21±0.42(1) 1.84±0.40(1)(2) 2.46±0.48(1)(2)(3)7 d - 1.01±0.14(1) 1.73±0.85(1)(2) 2.04±0.34(1)(2)(3)

表3 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者不同时间点脑脊液中NSE、S100B的表达(±s)Tab.3 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

表3 不同GCS评分重症中暑脑损伤患者不同时间点脑脊液中NSE、S100B的表达(±s)Tab.3 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

GCS. 格拉斯哥昏迷量表；NSE. 神经元特异性烯醇化酶；S100B. 脑活性肽100B蛋白；与对照组比较，(1)P<0.05；与轻度损伤组比较，(2)P<0.05；与中度损伤组比较，(3)P<0.05。

指标 对照组(n=96) 轻度损伤组(n=32) 中度损伤组(n=32) 重度损伤组(n=32)NSE 0 h 5.36±1.45 24.23±5.17(1) 31.81±6.12(1)(2) 41.46±7.10(1)(2)(3)1 d - 27.64±5.66(1) 36.40±5.84(1)(2) 45.35±8.40(1)(2)(3)3 d - 35.43±7.12(1) 44.92±7.74(1)(2) 53.18±9.16(1)(2)(3)7 d - 30.31±6.78(1) 33.86±6.24(1)(2) 48.14±8.05(1)(2)(3)S100B 0 h 1.10±0.26 1.34±0.78(1) 1.65±0.56(1)(2) 1.89±0.73(1)(2)(3)1 d - 1.77±0.70(1) 1.82±0.30(1)(2) 2.26±0.37(1)(2)(3)3 d - 1.56±0.48(1) 2.38±0.94(1)(2) 2.94±0.40(1)(2)(3)7 d - 1.43±0.64(1) 2.06±0.57(1)(2) 2.58±0.19(1)(2)(3)

表4 重症中暑脑损伤患者血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白表达与GCS评分的相关性Tab.4 The correlation between the expression levels of NSE and S100B protein and the GCS score in patients with severe heatstroke-induced brain injury

随着全球气候变暖、热浪袭击频率和强度逐年增加，重症中暑的发生率、病死率越来越高[7]。中枢神经系统是对高热最敏感的器官，体内高热能迅速引起脑细胞发生损伤(肿胀、固缩、崩解甚至死亡)，从而出现不同程度的脑功能受损[8-9]。研究发现，NSE、S100B作为脑组织损伤的标志物，正常情况下主要存在于中枢神经系统中，但在脑损伤后透过血脑屏障进入血液循环，在外周血和脑脊液中表达量增加，其水平越高，表明脑损伤程度越重，是评估脑功能损伤严重程度和预后的特异性和敏感性指标[10-12]。既往动物实验结果显示，重症中暑热打击可造成脑组织细胞水肿、细胞核破裂碎解以及发生炎性改变，从而造成不同程度的脑组织损伤[13]，且热打击后脑组织的缺血缺氧、炎症反应、氧化损伤，以及脑细胞凋亡、自噬等是导致继发性脑功能恶化的关键因素：①缺血缺氧。严重热打击可即刻引起海马、下丘脑等部位的缺血缺氧性损 伤[14]，且其继发的脑血管功能障碍、颅内高压会加重缺血缺氧，形成恶性循环[9]。②炎症反应。热打击早期即可使血液内高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)水平迅速增高，促使炎性因子大量表达，而肠黏膜屏障破坏使炎性因子入血进入颅内，加重脑组织损伤[15-16]。 ③氧化损伤。热打击可明显增加海马内氧化损伤因子[14]及细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的释放，大量ROS不仅介导细胞凋亡，还能直接损伤溶酶体膜[17]。④脑细胞凋亡、自噬。严重热打击可致使神经元DNA裂解；重症中暑所致的脑缺血缺氧还可继发脑细胞凋亡、自噬[18]。在上述因素的作用下，重症中暑患者会快速出现海马等部位的缺血缺氧、炎症反应、氧化损伤、神经元坏死及凋亡等，导致中枢神经系统功能障碍，从而引起重症中暑脑损伤。因此，测定重症中暑脑损伤后NSE、S100B蛋白的表达水平，可在一定程度上反映热打击后继发性脑损伤的严重程度；且NSE和S100B在脑内的分布存在差异，出现时间及高峰时间均不同，两者联合检测可更全面地反映脑组织损害的情况。

NSE是神经元的标志酶，S100B是神经胶质细胞的标志蛋白，在绝大多数脑损伤疾病中，神经元和神经胶质细胞均会有不同程度的损伤，NSE、S100B动态联合检测对颅脑损伤患者的诊断及预后判断有着重要意义。Sørensen等[19]研究发现，外周循环血中NSE、S100B水平增高的时间滞后于脑脊液，表达水平也明显低于脑脊液；牛莉莉等[20]研究缺血性脑卒中动物发现，血清及脑脊液中S100B及NSE在不同时间段呈趋势性变化，脑脊液中S100B及NSE水平增高的时间均早于外周血，且脑脊液中增高的水平是外周血的几十倍甚至几百倍。本研究发现，病例组血清及脑脊液中NSE及S100B蛋白的表达水平明显高于对照组，同等程度脑损伤患者脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平高于外周血(P<0.05)，提示重症中暑热打击可导致脑组织神经元及血脑屏障受损，NSE、S100B在大脑中的特异性及脑脊液检测中的灵敏度均高于外周血，可作为重症中暑脑组织损伤的生物学标志物。Zaheer等[21]的研究发现，患者血清NSE水平与脑缺血严重程度呈正相关，与格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分呈负相关，即GCS评分低的患者却具有较高的NSE水平；Ye等[22]的研究发现，血清S100B水平与脑梗死患者的诊断、预后具有相关性，梗死后S100B水平越高，预后越差。本研究结果表明，随着脑损伤程度加重，血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平增高，NSE与S100B的表达呈正相关，且NSE、S100B均与GCS评分呈显著负相关，提示NSE、S100B亦可作为重症中暑脑损伤严重程度的客观反映指标，为重症中暑致中枢神经系统功能性损害提供了新的理论依据。相关研究指出，脑损伤患者血清及脑脊液中S100B、NSE水平在不同时间点呈趋势性变化，达到峰值后随着时间延长以及中枢神经系统损伤的修复，可逐渐恢复至正常水平[20,23]。本研究结果显示，不同时间点重症中暑脑损伤患者血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平不同，随时间改变呈差异性变化(P<0.05)，提示血清及脑脊液中S100B、NSE的连续监测可用于评估脑损伤伤情和预测临床结果。

本研究尚存在一定的缺陷和不足：①由于研究时间短、入组对象少等综合因素导致研究规模较小，以及重症中暑脑损伤患者脑组织标本难以获取而不能检测脑组织中NSE、S100B蛋白的表达水平并进行病理学检测观察中暑脑组织显微结构变化等，影响了研究结果的精确性和准确性；②由于中暑患者发病至入院就诊间隔时间长短不一且难以把握，重症中暑脑损伤患者入院后不同时间点血清及脑脊液中NSE、S100B蛋白的表达水平不能代表发病后不同时间的表达水平，且病例组和对照组人群未做到完全匹配，研究方案需要进一步改进与细化以提高研究结果的精确性及准确性；③由于重症中暑脑损伤患者病情危重，治疗过程中未能及时动态完善头颅CT及MRI等影像学检查，从而未能联合NSE、S100B指标进一步佐证重症中暑致中枢神经系统功能性损伤；④本研究结果仍需要大量更加完备的研究设计深入探讨及验证。

综上所述，本研究发现，NSE、S100B水平在重症中暑脑损伤患者的血清及脑脊液中异常增高，与疾病严重程度及GCS评分显著相关，推测其可作为判断重症中暑脑损伤严重程度的标志物之一。