卵胞浆内单精子注射对后代安全性影响的研究进展

邵帅，江梅，丁涛，姜经航，王开秀，王婷婷，李长超

(湖北省荆门市第二人民医院，1.生殖医学科；2.检验科，荆门 448000)

卵胞浆内单精子注射(ICSI)又称“第二代试管婴儿”，是直接将单个精子注射到卵母细胞胞浆内，使其受精形成胚胎进行移植受孕。ICSI是在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)基础上发展起来的显微受精技术，常用于男性严重少弱畸精子症、无精子以及IVF受精失败等的治疗[1]。ICSI 技术对精子的要求比较低，受精率高，是目前治疗男性不育最有效的技术[2]。虽然 ICSI 在临床上的应用比较成熟，但ICSI 操作的步骤包括透明质酸酶的作用、机械去除卵母细胞周围的颗粒细胞、精子的制动、注射针对卵母细胞的侵入性操作、精子顶体注射以及精子制动液注射到卵母细胞内等各个环节都可能影响胚胎以及后代的发育，具有潜在的遗传风险[3-4]；而且ICSI技术避开了精子自然选择的过程，可能会增加新生儿出生缺陷的患病率[5]。由此引发ICSI 出生后代是否与自然出生的人群存在安全性、遗传性及其他方面的差异尚不可知。因此，本文主要对ICSI导致的先天畸形、表观遗传疾病、染色体异常、不育、代谢性疾病、癌症等研究做一综述，以便为生殖中心的ICSI规范操作提供相关依据。

一、先天性畸形

先天性畸形是指先天结构或功能异常，可能是由遗传或多种因素造成的，但在大多数情况下原因未知。2015年加利福利亚的一项回顾性队列研究发现，ICSI应用于非男性因素不孕时，与IVF相比会增加自闭症的风险[6]。此外，美国国家辅助生殖技术中心监测系统从1996年至2012年的数据显示，在非男性因素不孕患者治疗中，与传统IVF相比，ICSI出生新生儿伴随着低出生体重率和低多胎率；而在植入率、妊娠率、流产率、早产率和低出生体重等方面，男性因素与非男性因素不孕症的结果并无显著性差异[7]。Tararbit等[8]发现，ICSI出生新生儿与法洛四联症风险显著相关，但与其他先天性心脏病风险不相关。Lacamara等[9]通过系统回顾和Meta分析发现，ICSI单胎妊娠出生的新生儿与自然受孕的新生儿相比，发生先天性畸形的风险更高；同时研究结果也显示辅助生殖技术(ART)存在相关风险，包括配子体外操作、胚胎冷冻与解冻等；除了与父母特征相关的因素如母亲或父亲的年龄、男性不育因素外，先天性畸形的发生还与社会经济地位、妊娠期间使用的药物、诱发卵巢过度刺激的方法等有关。然而，Zhu等[10]研究发现，在IVF和ICSI的新生儿出生缺陷中，不管单胎还是双胎其发生率均无显著性差异；在评估冻融胚胎移植(FET)出生新生儿时，也未发现IVF出生新生儿和ICSI出生新生儿之间存在出生缺陷风险上的统计学差异。对于AZF微缺失的患者，应用ICSI也可以获得良好的临床妊娠结局，ICSI患者与非ICSI患者出生的新生儿结局无显著性差异[11]。Jwa等[12]并未发现与ICSI出生新生儿相关的先天性畸形风险增加，即使分析ICSI获得的冻融胚胎以及移植不同发育阶段胚胎，也得出同样的结论。

综上所述，经ART助孕新生儿和先天性畸形风险之间的联系仍然不明确，这可能与个体异质性、研究设计的针对性、选择偏倚以及Meta分析限制等导致的畸形总数偏低有关。鉴于患者的疾病和ICSI适应证也可能与畸形风险有关，因此将较高的遗传风险完全归因于ICSI似乎有些牵强。

二、表观遗传疾病

表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表型却发生了改变。表观遗传学主要通过DNA修饰、蛋白质修饰与非编码 RNA 调控 3个层面上调控基因表达。Choux等[13]通过前瞻性研究将IVF/ICSI单胎妊娠结局和自然妊娠结局进行比较，发现IVF/ICSI胎盘样本中一些转位因子和印迹基因发生了甲基化和转录改变，表明IVF/ICSI可能会导致胎盘表观遗传改变。研究表明，IVF/ICSI与H19甲基化显著降低、IGF2和SNRPN甲基化显著升高相关，而印迹基因表达异常和DNA甲基化可能与印迹障碍和其他生长发育相关疾病有关，需要进一步调查ART对健康的长期影响[14]。在不育男性检查中发现印迹基因GTL 2和H19 异常表达，表明男性不育与精子中印迹位点甲基化异常相关，一些少精子症患者精子中存在的印迹位点甲基化异常现象，通过ICSI能够遗传给后代[15]。Hattori等[16]研究认为，与ART相关的印记障碍可能倾向于在受精后不久出现，即在表观基因组最脆弱的时候发生，并可能受到ICSI操作技术及受精卵培养基组分的影响。外源性促性腺激素刺激引发的卵巢相关激素改变和成熟卵母细胞的采集均可导致ART助孕新生儿的表观遗传障碍或印迹缺陷风险的增加。此外，受精操作和胚胎培养条件可能会改变DNA甲基化状态，从而增加印迹障碍的风险。

研究人群和组织样本的异质性以及不同的实验室操作方法可能导致了模棱两可的结果。但显而易见，虽然自然受孕的新生儿和ART受孕的新生儿之间确实存在着印迹和表观遗传的差异，但这种差异对其生长发育的影响是微乎其微的。

三、染色体异常

ICSI已成为治疗男性不育症的首选方法，但由于不育患者的精子染色体异常频率升高，妊娠头3个月的染色体非整倍体率可能会增加。染色体分离异常会引起成熟生殖细胞的染色体异常，并导致胚胎染色体异常。事实上，非整倍体和染色体结构畸变是导致受精失败、植入失败、自然流产、死胎、先天性畸形以及精神和行为功能障碍的主要因素。因此，不育夫妇进行ICSI治疗时，后代染色体异常的风险可能会增加，因为这种技术通过注射染色体异常精子会使染色体非整倍体遗传给下一代。

男性因素不育治疗中，ICSI助孕可以提高受孕成功率，但也增加了非整倍体和染色体结构重排的发生率，导致妊娠率和着床率偏低而流产率偏高[17]。一般来说，通过ICSI受孕的后代染色体异常发生率偏高，特别是后代性染色体非整倍体的风险比自然受孕和IVF受精的后代更高[18]；但Belva等[19]研究发现，ICSI出生新生儿核型异常率为3.2%，主要与大量新发常染色体异常有关，而非与性染色体异常有关；在产前和产后取样的联合组中，发现了1.9%的新生儿染色体异常率且高于一般人群，这与父亲的精子数量有关。由于以上结果均出自男性不育症文献，因此有理由认为ICSI出生新生儿的染色体异常风险与不育父亲的低质量精子有关，而非ICSI技术本身。

四、不育

ICSI自1992年诞生以来，至今才有20多年，对ICSI出生后代的生育状况检测尚有诸多不便。因为男性不育可能会损害睾丸间质细胞功能和降低血清睾丸激素水平，而3月龄时垂体-睾丸轴暂时活跃，因此3月龄的婴儿血清睾丸激素可以作为ICSI成年生殖功能的预测指标，据此可以比较ART出生的婴儿和自然受孕婴儿的睾丸功能。研究显示：ICSI出生男孩和IVF出生男孩的血清生殖激素[FSH、LH、抑制素B和睾酮(T)]水平无显著性差异；因男性因素不育采用ICSI出生男孩的血清总T和游离T水平显著低于自然受孕出生男孩，而LH/T比率高于自然受孕出生男孩；因女性因素不孕采用IVF助孕出生男孩和自然受孕出生男孩的血清生殖激素比较无显著性差异；提示ICSI出生男孩的睾丸间质细胞功能受损，可能遗传自父亲，因此成年后需进行生殖健康检查[20-22]。Catford等[23]研究发现，与同龄的正常男孩相比，因男性因素不育采用ICSI出生的3月龄男孩的血清T较低，LH/T比率较高；ICSI出生的年轻成年男性精子发生障碍，精液质量下降，还有较高的FSH水平和较低的抑制素B水平。Belva等[24]研究发现，ICSI出生男孩的青春期内分泌功能正常，但唾液T水平以及抑制素B水平等在成年早期不正常，并且ICSI出生青年男性的精液质量和数量均有所下降；通过ICSI助孕导致精子发生异常的代际遗传可能性有待进一步研究。

Y染色体微缺失通过ICSI传递给男性后代，导致其有很高的不育风险，如核型为inv(9)(p11q13)就可以通过ICSI传给后代；某些Y染色体微缺失，包括最常见的gr/gr微缺失，不一定会导致后代男性不育，但会增加不育的风险。Y染色体缺失的男性患者其女性后代不会增加患先天性异常或不孕症的风险。因此，对 Y染色体微缺失男性不育患者行ART治疗时，可以进行特定的产前诊断(包括胚胎植入前遗传学诊断)，以筛查胎儿性别或者确定是否存在Y染色体微缺失[25]。

ART出生的女性后代其生育状况的数据很少。有研究显示，ART出生的18～22岁女性与自然受孕出生的女性对照组相比，两组间血清抗苗勒管激素、FSH水平及窦卵泡计数比较均无显著性差异[22]。

以上研究表明，ICSI出生的男性后代可能会存在源自父系的生育能力缺陷，而ICSI出生的女性后代因现有资料太少，无法对其生育能力作出任何推测。

五、代谢性疾病

ART过程包括卵巢刺激、配子操作和胚胎培养等，都发生在基因组甲基化模式建立的关键窗口期。有研究者认为，DNA甲基化的改变会影响基因转录调控，并可能增加儿童和成人患心脏代谢疾病的风险[26]。肥胖或超重妇女的胚胎常常表现出发育和代谢状况不佳，究其原因，肥胖或超重妇女的卵母细胞比正常女性的卵母细胞要小，发育成囊胚期的概率降低，为促进其发育，滋养外胚层的细胞数量相应减少，从而对着床和胚胎产生负面影响；这些胚胎也表现出明显的代谢变化，葡萄糖消耗减少、氨基酸代谢改变、甘油三酸酯水平增加等，可能对后代有潜在的不良影响。在胚胎发育过程中，胚胎所处的微环境若发生根本性的变化，可能会导致心脏代谢途径发生永久性的改变[27]。Kosteria等[28]通过血清蛋白质组学分析发现ICSI出生的孩子中有19个高表达蛋白和3个低表达蛋白，大多数过表达蛋白与急性期反应、凝血、补体通路激活以及铁和脂代谢有关，提示亚临床不良的心脏代谢特征。Vlachopoulos等[29]研究发现，ART后代中血清前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)水平随着年龄的增长而增加，提示心血管风险的增加可能与其导致的血脂状况的逐渐恶化有关；与ICSI相比，IVF治疗伴随较高水平的脂蛋白a[Lp(a)]。其他研究表明，在IVF/ICSI出生的后代中，新生儿、婴儿和儿童的生长发育与血压呈正相关，儿童生长与血管内皮细胞功能呈负相关[30]。ICSI出生的男性后代其体内高密度脂蛋白(HDL)的平均浓度较低，而代谢综合征的其他标志物则不受受孕方式的影响[31]。

六、癌症

丹麦的一项调查研究显示，1996至2015年出生儿童中，FET出生儿童与自然生育的儿童患癌比例分别为44.4/100 000和17.5/100 000，两者间有统计学差异[32]。一项系统回顾性分析显示，与自然受孕的后代相比，ART出生后代的患癌风险总体增加；在对癌症类型的分析中发现，ART出生后代罹患特定类型癌症的风险有所增加，包括肝母细胞瘤和横纹肌肉瘤、神经系统肿瘤、恶性上皮肿瘤、白血病以及霍奇金淋巴瘤[33]。也有研究发现，有生育问题女性的后代患癌症的风险总体上有所增加，这可能与母亲遗传有关[34]；是否存在其他潜在的致癌因素还未可知，有可能先天因素才是(儿童)癌症的最重要原因而非ART技术所致。因此，建议进行更多的相关研究。然而Spaan等[35]研究发现，与自然受孕的儿童或与普通人群相比，ART出生的后代总体患癌风险并没有增加，ICSI或FET出生的儿童患癌风险有轻微但不显著的增加；与自然受孕的儿童相比，ART受孕的儿童发生淋巴细胞白血病和黑色素瘤的风险无显著增加。不同类型的癌症可能有不同的病因，尽管ART治疗后出生的儿童总体患癌风险没有增加，但某些特定类型的癌症发生风险可能会有所增加。在ART分层分析中，ICSI和常规体外受精儿童间的癌症发生率无显著性差异。

总 结

ICSI技术的问世给男性不育患者的治疗带来了希望，是一项革命性的技术突破。毕竟至今只有28年的应用时间，所以ICSI的安全性一直备受人们的广泛关注。不可否认，大部分研究认为ICSI子代和自然妊娠儿童健康状况相似，ICSI是相对安全的；除了以上ICSI出生后代相关问题需要担忧以外，还有神经系统及认知发育、社会心理发育、子代出生缺陷等方面也值得关注和担忧。因此，ICSI技术的安全性仍值得关注，有待大规模、长时间的随访。