表达重症急性呼吸综合征病毒刺突蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

汤筱艳，刘任强，山 丹，潘 丹，王喜军，葛金英，温志远，步志高

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

重症急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）是由重症急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCoV）引起的一种急性、发热并伴有呼吸系统感染等严重并发症的人兽共患病。2002 年11 月首例SARS病例出现于我国广东省，然后迅速蔓延全国并扩散到加拿大、越南、新加坡、泰国等26 个国家。SARS 的病原体SARS-CoV 是一种有囊膜，不分节段的单股正链RNA 病毒，属于巢氏病毒目（Nido⁃virales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、β-冠状病毒属（β-Coronavirus）成员[1]。刺突蛋白（Spike protein，S）是SARS-CoV 的跨膜糖蛋白，可以介导病毒与细胞受体血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）结合[2]，是病毒刺激机体产生特异性中和抗体最重要的蛋白[3]。2017 年Shi 等人研究推测蝙蝠是SARS-CoV 的自然宿主[4]，说明SARS-CoV的感染依然存在重新暴发的可能性。2019 年12 月我国湖北省武汉市爆发了严重的COVID-19 疫情，研究表明该新型冠状病毒SARS-CoV-2 可能来源于SARS-CoV 前体蝙蝠冠状病毒HKU9-1[5]。因此研发SARS-CoV疫苗对我国的公共卫生安全具有重要意义。

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一种不分节段的单股负链RNA 病毒，属于单分子负链RNA 病毒目（Mononegavirales）、副黏病毒科（Para⁃myxoviridae）、禽副黏病毒属（Avulavirus）成员[6]。现在将重组NDV 作为载体的疫苗研究已较为成熟，NDV 作为活病毒疫苗载体有很多独特的优点：NDV可以同时诱导多种免疫应答，包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫；NDV 只有一个血清型，遗传性相对稳定；重组NDV 疫苗对多种动物免疫后均可以产生较好的免疫效果，可以通过接种中间宿主切断病毒的传播途径；NDV 的易感动物主要是禽类，对人体致病力极低，这是NDV 成为疫苗载体的首要条件。同时本实验室已经成功构建多种人兽共患病的重组NDV 病毒，例如表达中东呼吸综合征冠状病毒（Middle east respiratory syndrome coronavirus，MERSCoV）S 蛋白的rLa-MERS-S[7]，表达水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）G 蛋白的rLa-VSVG[8]，表达马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）G 蛋白的rLa-MARVGP[9]等，这为本实验构建以重组NDV为载体的SARS-CoV 疫苗提供理论基础。

本研究利用实验室已经建立的NDV LaSota 弱毒疫苗株反向遗传操作系统，拯救表达了SARS-CoV S蛋白的重组病毒rLa-SARS-CoV-S，并通过BALB/c小鼠初步评价该重组病毒的安全性和免疫原性，为后续利用非人灵长类动物（Non-human primates，NHPs）进一步鉴定重组病毒的免疫原性奠定基础。本研究证明rLa-SARS-CoV-S 不仅具有成为SARS-CoV 储备性疫苗的潜在价值，同时也为研发SARS-CoV-2 疫苗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料表达T7 聚合酶的重组痘病毒vTF7-3 由NIH 的Moss 博士惠赠；重组NDV LaSota 弱毒疫苗株、NDV 感染克隆pBRN-FL-PmeⅠ以及辅助核蛋白（pBS-NP）、磷蛋白（pBS-P）和大聚合酶蛋白（pBS-L）重组质粒均由本实验室构建[10]；BHK-21 细胞由本实验室传代保存，用含5%胎牛血清的DMEM培养；鼠抗SARS-CoV S 蛋白高免血清由本实验室制备：将本实验室构建的重组病毒VSVΔG-SARS-S以1×106TCID50/0.1 mL 的剂量通过肌肉注射途径接种BALB/c 小鼠，免疫21 d 后对小鼠采血获得高免血清；鸡抗NDV 高免血清由本实验室制备：将NDV LaSota 弱毒株以2×106EID50/0.1 mL 的剂量通过滴鼻点眼的途径接种SPF 雏鸡，免疫14 d 后对雏鸡采血获得高免血清；pCAGG-SARS-CoV-S 克隆质粒由本实验室制备：将SARS-CoV S 蛋白基因片段克隆至pCAGG 载体获得克隆质粒；10 日龄的SPF 鸡胚由本研究所SPF 实验动物中心提供；6 周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂T4 DNA 连接酶和Pme I 限制性内切酶均购自NEB 公司；Prime Star DNA Polymerase 购自TaKaRa 公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgGFITC 和兔抗NDV F1 蛋白抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP 购自Genscript公司；小鼠IgG 标准品购自Southern Biotech 公司；PBS 购 自HyClone 公 司；Alexa Fluor 568 标 记 的 山 羊抗鸡IgG 抗体、TRIzol 试剂、鼠源反转录酶试剂盒（M-MLV）和磷酸钙转染试剂盒均购自Invitrogen 公司；预染蛋白Marker 购自Fermentas 公司；DL5000 DNA Marker 和胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物技术有限公司。

1.3 SARS-CoV S 蛋白基因的扩增和序列分析根据GenBank 中登录的SARS-CoV S 蛋白基因序列（AAP13441.1），设计上下游引物（rLa-SARS-PF: 5'-GACTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCG CCACCATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTC-3'/rLa-SARS-PR: 5'-GCGCGTTTAAACTCATTATGTGTAATG TAATTTGACACCC-3'），并且在SARS-CoV S 蛋白基因起始密码子ATG 前引入PmeⅠ限制性内切酶识别序列、基因起始序列、基因间隔序列、基因终止序列以及Kozak 序列；在下游引物中引入PmeⅠ限制性内切酶识别序列。以重组质粒pCAGG-SARSCoV-S 为模板，扩增预期全长3 768 bp 的SARS-CoV S 蛋白基因。将PCR 产物胶回收后克隆至pBlueScrip II KS（+）载体的EcoR Ⅴ位点，通过酶切和测序鉴定后将该重组质粒命名为pBS-SARS-CoV-S。

1.4 表达SARS-CoV S 蛋白的病毒基因组全长cDNA的构建重组质粒pBS-SARS-CoV-S经PmeⅠ酶切处理后，胶回收SARS-CoV S 蛋白基因片段，再连接到同样经过PmeⅠ酶切处理、并已做去磷酸化处理的NDV 感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ，通过测序鉴定后将表达SARS-CoV S 蛋白的全长cDNA 克隆命名为pBRN-FL-SARS-CoV-S。

1.5 重组病毒的拯救和RT-PCR 鉴定当BHK-21细胞在六孔板内生长密度为80%～90%时，将MOI 0.01 的表达T7 聚合酶的重组痘病毒vTF7-3 预先感染细胞1 h 后利用磷酸钙转染法，将pBRN-FL-SARSCoV-S 及辅助质粒pBS-NP、pBS-P 和pBS-L 分别以每孔5 μg、2.5 μg、1.25 μg、1.25 μg 共转染BHK-21 细胞，具体的转染方法参考文献[10]。当细胞产生细胞病变（CPE）并达到90 %以上时，收集细胞及上清液过滤后接种于10 日龄的SPF 鸡胚内，接种5 d 后收集50 μL 尿囊液并按照常规方法进行血凝（Hemagglutination，HA）实验，收获HA 实验结果为阳性的尿囊液即为拯救病毒，将拯救的重组病毒命名为rLa-SARS-CoV-S。

将rLa-SARS-CoV-S 接种10 日龄的SPF 鸡胚并连续传3 代后，收集HA 实验结果为阳性的尿囊液，利用TRIzol 试剂提取尿囊液中的总RNA。以SARS-CoV-SF/SARS-CoV-SR 为特异性引物进行RTPCR 扩增，并对扩增的PCR 产物进行测序分析。

1.6 重组病毒的western blot 鉴定将rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 以MOI 0.01 的剂量分别感染BHK-21 细胞，36 h 后收集细胞，利用细胞裂解液裂解后进行SDS-PAGE 电泳并将蛋白转印至PVDF 膜，5%脱脂乳室温封闭1 h。分别以鼠抗SARS-CoV S蛋白高免血清（1∶200）和兔抗NDV F1 蛋白抗体（1∶200）为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）和山羊抗兔IgGHRP（1∶5 000）为二抗，进行western blot 鉴定。

1.7 SARS-CoV S 蛋白在感染细胞中表达和定位的检测将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 以MOI 0.01 的剂量分别感染BHK-21 细胞36 h 后，用4%多聚甲醛室温固定细胞20 min；以鸡抗NDV 高免血清（1∶50）和鼠抗SARS-CoV S 蛋白高免血清（1∶50）为一抗，以Alexa Fluor 568 标记的山羊抗鸡IgG（1∶200）和山羊抗鼠IgG-FITC（1∶200）为二抗，采用DAPI 对细胞核染色。利用激光共聚焦显微镜观察。

1.8 重组病毒的体外生长动力学测定将100 μL rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 以1×104EID50的剂量分别接种SPF 鸡胚，分别在接种12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 收集尿囊液，测定鸡胚半数感染量（EID50），并绘制病毒生长动力学曲线。

1.9 重组病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）测定将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分 别 用PBS 做10 倍倍比稀释（10-5～10-9）。每个稀释度共接种5 个10 日龄的SPF 鸡胚，每个鸡胚分别接种100 μL 病毒稀释液；8 h 后每个稀释度再接种5 个10 日龄的SPF鸡胚，每个鸡胚分别接种100 μL 病毒稀释液。所有接种病毒的SPF 鸡胚每隔12 h 观察一次，连续观察7 d，并分别记录每个鸡胚的死亡时间，按病毒最高稀释度引起鸡胚的死亡时间计算rLa-SARS-CoV-S和NDV LaSota 的鸡胚MDT。

1.10 重组病毒的小鼠安全性实验将rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 分别以5×106EID50的剂量通过肌肉注射途径接种8 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠，同时把等体积的PBS 以相同的方式接种另外8 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠作为对照组。接种后每日观察小鼠的状况并测量体质量，连续观察14 d。

1.11 小鼠的免疫实验和免疫后血清抗体的检测将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分别以5×106EID50通过肌肉注射接种8 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠，同时把另外8 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠作为PBS 对照组；在免疫后第21 d 采用相同的办法加强免疫。分别在首免后21 d 和42 d 对小鼠眼眶后静脉丛采血制备血清；血清56 ℃灭活30 min，-80 ℃保存备用。以纯化后的S 蛋白作为抗原包被ELISA 板，待检血清稀释液为一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）为二抗，通过ELISA 实验检测小鼠血清中针对SARSCoV S 蛋白的特异性IgG 抗体水平。同时用已知浓度的小鼠IgG 标准品建立标准曲线，根据标准曲线计算小鼠血清中针对SARS-CoV S 蛋白的IgG抗体浓度。

2 结 果

2.1 表达SARS-CoV S 蛋白基因的重组病毒的构建与重组病毒拯救利用本实验室建立的NDV La⁃Sota 弱毒疫苗株反向遗传系统，利用PCR 方法将SARS-CoV S 蛋白基因插入经过PmeⅠ酶切、去磷酸化处理的NDV 感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ，通过酶切和测序鉴定后，将表达SARS-CoV S 蛋白基因的全长cDNA克隆命名为pBRN-FL-SARS-CoV-S（图1）。

图1 表达SARS-CoV S蛋白的重组NDV基因组全长cDNA的构建Fig. 1 Construction of genomic cDNA of recombinant NDV expressing SARS-CoV spike protein

将pBRN-FL-SARS-CoV-S 和辅助质粒pBSNP、pBS-P 和pBS-L 共 转 染BHK-21 细 胞，当 细 胞产生CPE 并达到90%以上时收集细胞及上清液，过滤后接种10 日龄的SPF 鸡胚中。接种5 d 后采集尿囊液进行HA 实验，HA 实验结果显示为阳性并且病毒尿囊液的血凝效价达到28。收获尿囊液，将拯救的重组病毒命名为rLa-SARS-CoV-S。

2.2 rLa-SARS-CoV-S 的RT-PCR 鉴定将rLa-SARS-CoV-S 在10 日 龄 的SPF 鸡 胚 中 连 续 传3 代后，利用TRIzol 试剂提取尿囊液中的总RNA。利用SARS-CoV-SF/SARS-CoV-SR 作为特异性引物进行RT-PCR 扩增，获得约3 800 bp 的片段（图2），同时测序结果显示该PCR 产物的基因序列与已知SARSCoV S 蛋白基因序列一致。结果表明SARS-CoV S 蛋白已经插入NDV LaSota 基因组中，初步证明已拯救重组病毒。

2.3 SARS-CoV S 蛋白表达的western blot 鉴定将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分别感染BHK-21细胞，感染36 h 后进行western blot 检测。结果显示，在rLa-SARS-CoV-S 感染的细胞中出现一条约为250 ku 的特异性条带（图3A）；同时利用兔抗NDV F1蛋白抗体，在rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分别感染的细胞中均可以检测到一条55 ku 的NDV F 蛋白（图3B）。结果表明SARS-CoV S 蛋白在重组病毒感染的细胞中可以正确表达。

图2 RT-PCR 鉴定rLa-SARS-CoV-SFig. 2 Identification of rLa-SARS-CoV-S by RT-PCR

图3 Western blot 检测SARS-CoV S 蛋白在感染细胞中的表达Fig. 3 Detection of the expression of spike protein in rLa-SARS-CoV-S infected cells by western blot

2.4 SARS-CoV S 蛋白在感染细胞中表达和定位的检测将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分别感染BHK-21 细胞后利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示，rLa-SARS-CoV-S 感染的细胞中存在S 蛋白和NDV 蛋白，两种蛋白共定位在细胞质和细胞膜上；而在NDV LaSota 感染的细胞中，未观察到S蛋白的特异性荧光（图4）。结果表明SARS-CoV S蛋白在重组病毒感染的细胞中可以正确表达并准确定位。

2.5 rLa-SARS-CoV-S 的生长曲线将rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 分别接种10 日龄的SPF 鸡胚后在不同时间点收集尿囊液并分别测定EID50。实验结果显示rLa-SARS-CoV-S 的生长趋势与亲本病毒NDV LaSota 基本保持一致，rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 的病毒滴度均在感染后48 h 达到峰值（图5）。本实验结果说明了重组病毒满足免疫滴度的要求，为后续利用小鼠鉴定重组病毒安全性和免疫原性提供了实验基础。

图4 激光共聚焦观察SARS-CoV S 蛋白在感染细胞中的表达和定位Fig. 4 Identification of SARS-CoV spike protein expression and localization in the infected cells by using confocal fluorescent microscopy

2.6 重组病毒的鸡胚MDT 测定将rLa-SARSCoV-S 和NDV LaSota 分别做10 倍倍比稀释后接种SPF 鸡胚，并记录每个鸡胚的死亡时间，按病毒最高稀释度引起鸡胚的死亡时间计算MDT。实验结果显示，NDV LaSota 引起两组鸡胚全部死亡的最高稀释度均为10-8，rLa-SARS-CoV-S 引起两组鸡胚全部死亡的最高稀释度均为10-7，进一步通过计算可以得知NDV LaSota 的MDT 为96 h，rLa-SARS-CoV-S 的MDT 为112.8 h。结果表明重组病毒仍然保持亲本病毒NDV LaSota 的低致病力特性。

图5 重组病毒rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 的生长曲线Fig. 5 Growth curves of rLa-SARS-CoV-S and NDV LaSota in chicken embryo

2.7 rLa-SARS-CoV-S 对小鼠的安全性实验将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分别接种BALB/c 小鼠，接种后连续14 d 观察小鼠的健康状况并测量体质量。结果显示感染组和对照组的小鼠全部存活，均没有表现出任何临床症状，并且两组小鼠的体质量增长趋势一致（图6）。结果表明重组病毒对小鼠具有较好的安全性，对小鼠不具有致病性。

2.8 rLa-SARS-CoV-S 免疫小鼠后抗体水平检测将rLa-SARS-CoV-S 和NDV LaSota 分别两次免疫BALB/c 小鼠，采集初次免疫后21 d 和42 d 血清进行ELISA 检测。结果显示rLa-SARS-CoV-S 在一免和加强免疫后均可以诱导小鼠产生较高水平的IgG 抗体，并且抗体水平可以维持较长一段时间；而接种NDV LaSota 和PBS 对照组无针对SARS-CoV S 蛋白的IgG 特异性抗体（图7）。结果表明重组病毒可以诱导小鼠产生较高水平的IgG 抗体，对小鼠具有良好的免疫原性。

图6 感染后小鼠的体重增长趋势Fig. 6 The weight gain trend of inoculated mice

图7 rLa-SARS-CoV-S 免疫小鼠后IgG 抗体水平分析Fig. 7 ELISA analysis of mouse serum against rLa-SARS-CoV-S

3 讨 论

SARS 是一种流行范围广泛、传染性强、死亡率高的人兽共患病，研发SARS-CoV 疫苗是建立有效防控该病措施的关键环节。目前正在研发的SARSCoV 疫苗种类很多，包括灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗等。但是这些疫苗均存在部分缺点，例如灭活病毒疫苗需要多次免疫才能产生较好的免疫保护作用；减毒活疫苗存在疫苗毒力返祖或交叉感染可能性；DNA 疫苗具有将外源DNA 整合到宿主基因组的风险；亚单位疫苗的免疫原性较低，需要适当佐剂才可以产生较好的免疫保护作用。NDV 作为一种活病毒疫苗载体，具有免疫效果良好、诱导免疫途径广泛、遗传性稳定、安全性高等独特的优点，因此NDV 反向遗传操作技术已经广泛用于新型疫苗的研发中。针对复杂的国际环境以及SARS 传播速度快、感染率高和死亡率高的特点，研制一种快速、有效、安全的SARS-CoV 疫苗是SARS 防控工作重点，而研发以重组NDV 为载体的SARS-CoV 疫苗可以满足人们的需求。

本研究利用实验室建立的NDV LaSota 弱毒疫苗株反向遗传操作系统，拯救出表达SARS-CoV S 蛋白的重组病毒rLa-SARS-CoV-S。RT-PCR 实验结果表明外源基因S 蛋白插入NDV 基因组，初步证明重组病毒被成功拯救；Western blot 与激光共聚焦实验表明S 蛋白在感染细胞中可以正确表达与定位，进一步证明重组病毒构建成功；MDT 实验表明rLa-SARS-CoV-S 仍然保持亲本病毒NDV LaSota 疫苗株的低致病力特性，说明在NDV 基因组中插入外源蛋白基因S 不会改变重组病毒的遗传稳定性；病毒的生长动力学曲线结果表明rLa-SARS-CoV-S 与NDV LaSota 的生长趋势基本一致，均可在鸡胚中产生较高的病毒滴度，满足动物免疫实验的滴度需要。BALB/c 小鼠安全性实验结果表明rLa-SARS-CoV-S对小鼠不具有致病性；将rLa-SARS-CoV-S 免疫小鼠后检测小鼠血清中的抗体水平，ELISA 实验结果表明初次免疫该病毒就能诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG 抗体，加强免疫后抗体水平显著提高，并且能维持较长一段时间。虽然中和抗体效价检测是评估疫苗免疫原性的重要环节之一，但由于SARS-CoV 必须在生物安全防护三级实验室（Biologi⁃cal safety protection third-level laboratory，BSL-3）中操作，以及按照国家相关SARS 的法律规定，因此无法使用活毒对小鼠进行攻毒保护实验与中和实验。

本研究表明重组病毒rLa-SARS-CoV-S 对小鼠有较高的安全性和良好的免疫原性，具有作为SARS-CoV 储备性候选疫苗的潜在价值，同时也为研发SARS-CoV-2 疫苗提供新思路。