两株H9N2 亚型禽流感病毒的基因组序列分析及其对小鼠的致病性研究

侯玉杰，尹 馨，房敬真，邓国华，崔鹏飞，王冬雪，施建忠，陈化兰

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正黏病毒科A 型流感病毒属，根据病毒表面蛋白HA和NA 的抗原性差异，可将从鸟禽中发现的A 型流感病毒分为16 种HA 亚型和9 种NA 亚型[1]。此外，研究人员还从蝙蝠体内分离到了两种新的A 型流感病毒，H17N10 和H18N11[2-3]。H9N2 亚型AIV 在世界范围内广泛分布，该病毒不仅感染家禽和野生鸟类，还可以感染哺乳动物，其中，野鸟被认为是H9N2 亚型AIV 的自然储存宿主。

H9N2 亚 型AIV（A/turkey/Wisconsin/1/1966）于1966 年首次从美国威斯康星州的火鸡中分离[4]。在过去的几十年间，H9N2 亚型AIV 已经在世界范围内的野禽、家禽和猪体内被分离到[4-6]。研究发现，该病毒不需要提前适应即可在小鼠体内有效复制[7]，并且一些从亚洲地区家禽中分离的病毒已经具备了结合人型受体的能力[8]。Sorrell 等发现携带人源H3N2 内部基因与禽源H9N2 表面基因的重组病毒在雪貂体内适应后可以在雪貂间通过呼吸道飞沫传播[9]。还有研究发现，2009 年甲型H1N1 亚型流感病毒与H9N2 亚型AIV 重组后对小鼠的致病力更强，同时在雪貂之间具有更强的传染性[10]。

在我国，1994 年科学家在广东省鸡群中首次分离到H9N2 亚型AIV，随后该病毒逐渐传播至其他省份。目前，该亚型AIV 在我国已分布极其广泛，在大部分的活禽市场和个别养殖场的家禽中均有可能分离到，但由于其对家禽呈现低致病力而往往被人们忽视。2014 年李旭勇等研究发现，2009 年至2013年在我国南方活禽市场中分离到的H9N2 亚型AIV均具备优先结合人型受体的能力，但同时依然保留了禽型受体的结合能力；在雪貂感染模型上检测的9 个病毒中的6 个病毒可通过呼吸道飞沫传播[11]，表明H9N2 亚型AIV 具有重要的公共卫生学监测价值。而且，该亚型AIV 分别在1999 年、2003 年和2013 年在我国出现感染人事件[12-14]，提示需要密切监测该亚型AIV。另外，H9N2 亚型AIV 不仅直接造成人的感染，而且还可以和其它亚型AIV 重组产生新的病毒，进而导致人的感染和死亡。最典型的例子为1997年香港暴发的H5N1、2013 年首次在我国出现的新型H7N9 以及H10N8 病毒，其内部基因均来源于该亚型病毒[15-20]，这对人类公共卫生安全构成了严重威胁。本研究通过对2019 年青海地区两株不同来源的H9N2亚型AIV 进行全基因组序列测定、遗传演化分析，不仅探讨了野鸟携带该亚型病毒对家禽界面跨种类传播的风险，还开展了对BALB/c 小鼠的致病性试验，初步评估了其对哺乳动物的感染风险，对H9N2 亚型AIV 的监测和有效防控AI 具有一定的指导价值。

1 材料与方法

1.1 病毒株及实验动物2019 年春季从青海省分离到的两株H9N2 亚型AIV：CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019，由国家禽流感参考实验室分离鉴定并保存；10 日龄SPF 鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 主要试剂病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司；EasyTaq DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；测序反应试剂盒Big Dye Terminator 3.1 购 自 美 国ABI 公 司。

1.3 病毒纯化及鸡胚半数感染量（EID50）测定将H9N2 亚 型AIV CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019 经含有青霉素、链霉素和头孢的PBS 10 倍倍比稀释后接种10 日龄SPF 鸡胚，37 ℃孵化48 h 后于4 ℃过夜，收取最高稀释度、最高血凝价的鸡胚尿囊液，如此连续纯化3 代后，收获的病毒分装于冻存管中并置于-70 ℃备用。取纯化后的病毒以10 倍倍比稀释，每个稀释度接种5 枚10 日龄SPF 鸡胚，37 ℃孵化48 h 后检测各稀释度血凝阳性鸡胚数目，根据Reed-Muench 方法计算各病毒的EID50。

1.4 病毒全基因组测序及遗传演化分析采用病毒RNA 提取试剂盒提取病毒RNA，利用反转录试剂盒反转录为cDNA，并以其为模板，利用Hoffmann 等[21]的引物及反应条件分别对目的片段进行扩增。PCR产物经纯化后测序鉴定。测序结果利用DNAStar 软件中的SeqMan 拼接，利用MEGA 6.0 中的Clustal W法进行全基因组序列比对并绘制进化树。

1.5 小鼠的感染性试验参照文献[17, 22]，将两株病毒以106EID50/50 μL/只剂量鼻腔接种各8 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠，感染3 d 后随机迫杀3 只小鼠，取其脑、鼻甲、脾脏、肾脏、肺脏，通过鸡胚滴定法检测病毒在小鼠体内各脏器的复制情况，并根据Reed-Muench 法计算病毒滴度。剩余的5 只小鼠，每天记录体质量变化至感染后14 d，观察其临床症状，同时，设立PBS 对照组。

2 结 果

2.1 HA 基因同源性、特殊氨基酸序列位点及其进化分析对两株H9N2 亚型AIV 各目的片段扩增得到的8 个节段基因序列进行测序，拼接处理后通过NCBI 数据库Blast 比对分析，得到与各片段核苷酸同源性最高的病毒株（表1）。

表1 H9N2 亚型AIV 各基因节段核苷酸同源性最高的病毒株Table 1 Nucleotide homology of H9N2 avian influenza virus

病毒株CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019的HA 基因全长均为1 683 bp，编码560 个氨基酸，CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019 在HA 蛋 白裂解位点处的氨基酸序列均为333PSKSSR↓GLF，且均无多个连续的碱性氨基酸，理论上符合低致病性病毒株分子特征。两株病毒的HA 蛋白均具有7 个相同的潜在糖基化位点，其中5 个位于HA1亚 基，分 别 是11NST13、123NVS125、280NTT282、287NVS289、295NCS297，其 余2 个492NGT494、551NGS553位 于HA2 亚基。受体结合位点分析结果显示，两株病毒的HA蛋白氨基酸序列aa138、aa155、aa183、aa226（H3 亚型HA 蛋白氨基酸编码）均为典型的人源受体结合位点，即138A，155T、183N，226L，而aa228 为禽源受体结合位点G。遗传进化分析结果显示，两株病毒的HA基因虽均属于欧亚分支（图1），但其HA 基因的核苷酸同源性仅为92.7%，其中，CK/QH/S1182/2019 的HA 基因与NCBI 数据库中A/chicken/Xizang/XZ2102/2018（H9N2）株的HA 基因核苷酸同源性最高，为98.99%；WB/QH/S1355/2019 株与A/chicken/Shanghai/S1177/2018（H9N2）株的HA 基因核苷同源性最高，为98.81%。上述分析结果表明本研究的两株病毒HA 基因亲缘关系较远，无明显的直接进化关系。

图1 HA 基因进化树Fig. 1 The phylogenetic tree of HA gene

2.2 NA 序列特殊氨基酸位点及其进化分析CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019 株 的NA 基 因 全长均为1 401 bp，编码466 个氨基酸。两株病毒的NA 基因均发生了颈部缺失。两株病毒的NA 蛋白具有6个相同的潜在糖基化位点：分别为66NST68、83NWS85、143NGT145、197NAT199、231NGT233、365NGS367。遗传进化分析结果显示，两株病毒的NA 基因均属于欧亚分支（图2），且NA 基因的核苷酸同源性高达100%，与NCBI 数据库中A/Chicken/China/63/2019（H9N2）株的NA 基因核苷酸同源性高达99.07%，提示本研究中的野鸟携带的H9N2 亚型AIV 与家禽来源的H9N2 病毒可能存在NA 基因重配的可能性。

图2 NA 基因进化树Fig. 2 The phylogenetic tree of NA gene

2.3 内部基因序列特殊位点及进化分析内部基因序列分析显示，CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019 株的PB2 蛋白氨基酸序列aa271、aa627 和aa701均未发生T271A、E627K 或D701N 对哺乳动物致病力增强的突变。两株病毒的PB1 蛋白氨基酸序列aa368和aa622 均发生了I368V 和D622G 提高病毒传播能力和聚合酶活性的突变，PA 蛋白出现了K356R 增强病毒复制和哺乳动物致病力的突变，NP 蛋白均发生了V41I 和D210E 对聚合酶活性有增强作用的突变，M1 蛋白的第30 位氨基酸发生了N30D 对小鼠致病力增强的突变，同时，NS1 蛋白也出现了E172K 能增强病毒对哺乳动物致病力的突变。

两株病毒的PB1 基因均与NCBI 数据库中A/Chicken/Shanghai/02/2018（H9N2）株高度同源，同源性分别高达97.76%和98.64%；NP 基因均与NCBI 数据库中A/Chicken/Shanghai/1127-30/2017（H9N2）株高度同源，同源性高达99.00%。WB/QH/S1355/2019（H9N2）株 的M 基 因 与H7N9 亚 型AIV A/Chicken/Zhejiang/S1074/2016（H7N9）的M 基因亲缘关系最近，同源性达99.39%（图3）。另外，除了CK/QH/S1182/2019 株NS 基因与A/Chicken/China/71/2019（H9N2）NS基因的同源性为96.78%外，两株病毒的其余内部基因分别与不同H9N2 亚型流感病毒相应基因的同源性均在97.76%～99.88%，提示野鸟携带的H9N2亚型AIV与家禽来源的H9N2 病毒可能存在一定的亲缘关系。

2.4 病毒对BALB/c 小鼠的感染性试验将两株病毒以106EID50/50 μL/只的剂量感染小鼠后，小鼠未出现明显的临床症状，体质量在14 d 观察期内无明显变化（图4）。脏器病毒滴定结果显示，两株病毒均可在小鼠鼻甲中有效复制，CK/QH/S1182/2019和WB/QH/S1355/2019株在鼻甲中的病毒滴度分别为2.8 log10EID50/mL和3.4 log10EID50/mL，但分别只有1只和2只小鼠的肺脏中检测到上述两株病毒，在小鼠肺脏中的病毒滴度分别为1.3 log10EID50/mL 和1.1 log10EID50/mL。另外，在小鼠的脑、脾脏和肾脏中均未检测到病毒（表2），以上结果表明这两株病毒对小鼠呈现低致病力。

3 讨 论

研究发现2009 年至2013 年分离自我国南方活禽市场家禽的H9N2 AIV 部分病毒株已经获得了引起小鼠体质量下降的能力，大多数病毒均可结合人型受体[11]，该研究中的9 株病毒中有6 株病毒在雪貂之间可以通过呼吸道飞沫传播，表明了H9N2 亚型AIV具有重要的公共卫生学监测价值。

图3 内部基因进化树Fig. 3 The phylogenetic tree of internal genes

图4 小鼠感染病毒后的体质量变化Fig. 4 Weight change of mice after virus inoculation

表2 H9N2 亚型AIV 对小鼠的致病力和复制能力检测Table 2 Replication and virulence of H9N2 avian influenza viruses in mice

野鸟在AIV 的进化和传播过程中发挥着至关重要的作用，同时也是AIV 的重要传染源[23]，尤其是水禽，一直以来都被认为是家禽中暴发禽流感疫情的潜在感染源。大部分低致病性AIV 在野鸟体内能够长期适应且无明显的临床症状，但是可以在种群内或种群间长期循环存在。而野鸟（候鸟）迁徙为禽流感在种群内和种群之间的传播创建了时间和空间上的联系。本研究进化分析显示，CK/QH/S1182/2019 和WB/QH/S1355/2019 两 株H9N2 AIV 的NA、PB1及NP基因亲缘关系较近，但病毒基因节段均属于欧亚分支，核苷酸同源性高达99%～100%，表明野鸟携带的H9N2 AIV 与活禽市场鸡群中分离到的H9N2病毒亲缘关系较近，结合实验室流行病学调查结果和活禽市场监测数据，说明存在病毒随野鸟迁徙而传入家禽的可能性。而家禽中流行的H9N2 病毒与来自野鸟的流感病毒之间的重配会导致病毒不断进化，从而适应家禽宿主，因此，加强对迁徙候鸟和野鸟栖息地区AIV 的监测具有重要意义。

研究表明，活禽市场是人感染H5N1、H7N9 和H10N8 亚型AIV 的主要场所。家禽中流行的其它亚型AIV 与H9N2 亚型AIV 出现重组，非常容易发生内部基因的基因重配，从而导致感染人的新型流感病毒的出现，诸如H9N2 亚型AIV 在禽源新型流感病毒H7N9 的产生过程中起着举足轻重的作用[15-19]。所以在加强对迁徙候鸟和野鸟栖息地区AIV 的监测的同时，进一步加强对活禽市场的监管力度，建立和实施更加科学有效的活禽市场运营机制[24]，严格执行活禽市场消毒、休市和关闭政策，最大限度地减少活禽市场环境中H9N2 AIV 的污染数量，是防范市场中人群感染H9N2 AIV 的重要措施。

本实验对H9N2 亚型AIV 的持续监测和系统的生物学特性分析不仅可为我国对该亚型AI 疫情的防控提供有效数据支持，同时也为新型流感的防控提供了参考依据。