子午流注穴位电刺激对卵巢低反应患者辅助生殖结局的影响

刘娟 陆杉 王小云

广州中医药大学第二附属医院1生殖医学科，2妇科（广州510006）

随着女性生育年龄的推后，加上环境与疾病的各种影响，卵巢低反应（poor ovarian response，POR）的发病率逐年升高［1］。POR 对女性最严重的危害即为生育力下降或丧失。因此POR 患者如何在有限的卵巢功能基础上尽快妊娠已成为目前大多数生殖中心面临的一个难题。卵巢功能的下降几乎是不可逆的，目前尚无确切有效的方法恢复卵巢功能，只能延缓卵巢衰老的时间，或恢复残存卵泡的功能，争取机会怀孕［2］。中医针灸治疗不孕症历史悠久，通过针刺具有“补肾健脾、疏肝理气、活血化瘀”等穴位，起到助孕的作用。子午流注穴位电刺激仪是在传统穴位电刺激仪的基础上结合子午流注的理论，利用微电脑单片机技术，实现了子午流注与灵龟八法的精确时间计算。此方法具有安全、无创、患者依从性好、经济及时间穴刺激等优点，目前主要应用于脑病科及患者术后恢复治疗中，生殖领域尤其是卵巢低反应患者中使用未见报道。因此本研究从临床中常见且较为棘手的问题着手，探索中医穴位刺激的干预措施是否能有效提高POR 患者的卵巢功能，并分析此干预措施是否对后续的IVF 助孕治疗结局产生差异性影响，以评估POR 不孕症患者在IVF 助孕前行子午流注穴位电刺激预处理的安全性及有效性，现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择选取2018年12月至2019年12月在我科行IVF 助孕治疗的不孕症患者，纳入诊断为POR 的患者共70 例，采用随机数字表法随机分为子午流注穴位电刺激治疗组（A 组）和空白对照组（B 组），每组纳入患者35 例，纳入前均向患者告知干预措施随机分组方式，详细介绍干预措施已知的研究报道，告知研究过程及干预可能的获益等，本研究已获患者及家属知情同意，并获广东省中医院伦理委员会批准，批号：ZF2018⁃212⁃01。

1.2 病例筛选标准纳入标准：（1）年龄35～43 岁女性；（2）同时符合不孕症（诊断标准参考《妇产科学》［3］）及POR 西医诊断标准者（参考博洛尼亚共识（Bologna criteria，2011年）诊断标准。至少满足以下3 条中的2 条：①年龄≥40 岁，或具备POR 的任何危险因素；②曾有卵巢刺激反应不良病史，采用常规刺激方案，获卵数≤3 个；③一个异常卵巢储备试验结果，窦卵泡数（antral follicle count，AFC）计数<5 ～7 个，或抗苗勒管激素（anti⁃mulleri⁃an hormone，AMH）< 0.5～1.1 ng/mL 或2 次 基 础FSH 水平≥12 IU/L 者。即便患者不是高龄或者卵巢储备试验异常，在最大刺激下两次偶发的POR，也足够诊断患者属于卵巢低反应。常见人群为：a.高龄；b.前次超促排卵周期POR 者；c.具有影响卵巢储备和卵巢刺激反应性的获得性或遗传性疾病者，如卵巢手术、盆腔感染、化疗及盆腔放疗、遗传免疫性疾病和环境因素等；d. 高BMI 者［4］）；（3）符合中医证候辨证标准者（由两位副高级职称以上的医师共同认可：参考《中华中医药学会（ZYYXH/T203⁃246⁃2012）：中医妇科常见病诊疗指南，2012年》中“不孕症”证候标准。根据临床中患者的常见辩证种类，共选取四种症型：①肾阴虚；②肾虚肝郁；③肾虚血瘀；④脾肾两虚）。排除标准：（1）女性基础FSH 水平≥40 IU/L；（2）子宫内膜异位症Ⅲ⁃Ⅳ期；（3）染色体异常者；（4）男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病；（5）女性子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。

1.3 治疗药物及仪器（1）本研究中使用的相关药物如下：①克罗米芬（Clomiphene，CC），塞浦路斯高特制药有限公司，50 mg/片；②尿促性素（hu⁃man menopausal gonadotrophin，hMG），珠海丽珠制药，75 IU/支；③绒促性素（human chorionic gonado⁃tropin，hCG），珠海丽珠制药，2 000 IU/支；④重组人绒促性素（艾泽），德国默克雪兰诺，250 μg/支。（2）本研究中使用的仪器：ZWLZ⁃V 子午流注低频治疗仪，京佳时正通科技有限责任公司。

1.4 治疗方法

1.4.1 子午流注穴位电刺激治疗组

1.4.1.1 子午流注穴位电刺激穴位处方及取穴依据（1）开穴：根据患者就诊时间（年月日时）选取相应的2 个开穴（由子午流注低频治疗仪自动计算出灵龟八法穴位）。灵龟八法计算法：将日、时的干支数字，共同相加，得出四个数字的和数，按照阳日用九除，阴日用六除的公式，去除干支的和数，再将它的余数，求得八卦所分配的某穴的数字，为当时应开的腧穴，再根据此腧穴配对其对应的八脉交会穴，如：公孙配内关，临泣配外关，后溪配申脉，列缺配照海。（2）主穴：取中脘、气海、中极、商曲（左侧）、下风湿点（双侧）、子宫。中脘为胃募穴，有和胃健脾、通降腑气之功；气海属任脉，主治脏气虚惫，真气不足，存调补下焦、补肾益气、振阳固精之功；中极系膀胱之募穴，有补肾培元、清热利湿之功；商曲系肾经与冲脉之会穴，有调理肠胃之功；下风湿点与经外奇穴护宫重合，与关元合用时统称梅花三针，主治不孕症、附件炎、卵巢囊肿及其他妇科病；子宫：系经外奇穴，有调经理血，升提下陷之功。（3）配穴：根据不同证型选取相应的配穴：①肾阴虚——三阴交（双侧），系足太阴脾经、足少阴肾经、足厥阴肝经交会穴，有健脾益气、调补肝肾之功；②肾虚肝郁——太冲（双侧），足厥阴肝经输穴，原穴，为肝经的通道所在，原气所居之处，有疏肝理气、通络和血之功；③肾虚血瘀——大横，系足太阴脾经、阴维脉交会穴，能治肠腹气之病；④脾肾两虚——足三里（双侧），足阳明胃合穴，胃下合穴，主治五痨、羸瘦、亡阳、虚乏、胸瘀血、乳痈等症。所选择的穴位均参照中华人民共和国国家标准《经穴部位》的定位方法进行定位。

1.4.1.2 子午流注穴位电刺激治疗流程嘱患者排空膀胱，取平卧位，将ZWLZ⁃V 子午流注穴位电刺激仪（京佳时正通科技有限责任公司）的电极贴片按开穴—主穴—配穴的顺序分别贴于上述穴位上。开机，选择频率为2 Hz，强度为20～25 mA，以患者感觉舒适为度。每次20 min，非经期隔日1 次，一周3 次，1 个月经周期为1 个疗程，共治疗2 个疗程后结合IVF/ICSI 治疗。

1.4.1.3 IVF/ICSI促排卵治疗方法采用温和刺激方案：于月经期第2～3 天开始使用CC 50 mg 口服，每日一次；同时给予hMG 150 IU 直至扳机日，监测卵泡发育当1个主导卵泡径线≥18 mm 或2个主导卵泡径线≥17 mm 或3 个主导卵泡径线≥16 mm时，注射hCG 10 000 IU 或艾泽250 μg 扳机。扳机后34～36 h 经阴道B 超引导下穿刺取卵。取卵后由胚胎实验室人员完成捡卵、授精、胚胎培养工作。温和刺激方案由于使用了药物CC，影响子宫内膜容受性，需取消新鲜胚胎移植。形成的可利用胚胎则全部进行冷冻保存。冻融胚胎移植：根据患者的月经是否规则使用自然周期或人工周期准备内膜，在内膜转化3 d 后行冻融胚胎移植手术。常规复苏后培养2 h 再次对胚胎评级。根据卫生部要求，35 岁以下第1 次助孕周期移植胚胎数不得超过2 枚，每周期移植胚胎总数不得超过3 枚。

1.4.2 对照组只进行基础治疗，即促排卵与IVF/ICSI 助孕治疗，促排卵治疗方案及冻融胚胎移植策略同治疗组。

1.5 观察指标安全性指标：血常规、肝肾功能、心电图以及观察组患者不良反应发生的情况。效应性指标：（1）观察组干预措施前后卵巢功能比较（观察周期为子午流注穴位电刺激预处理后1 个月）：比较治疗组干预措施前后卵巢功能各项指标包括血清基础卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、基础黄体生成素（luteinizing hor⁃mone，LH）、基础雌二醇（estradiol，E2）、AMH 及AFC，以评估干预措施对POR 患者卵巢功能的影响。（2）IVF 助孕治疗后2 组患者的临床基本资料及卵子、胚胎质量情况比较（观察周期为子午流注穴位电刺激预处理后1 个月）。比较两组患者临床基本资料、促排卵用药情况、获卵数、成熟卵子率（metaphaseII，MII 卵率）、受精率、卵裂胚胎数、可利用胚胎数、优质胚胎数，以评估干预措施是否对IVF 助孕治疗结局产生差异性影响。（3）IVF 助孕治疗后2 组患者妊娠结局比较（观察组的观察周期为子午流注穴位电刺激预处理后3 个月）。比较两组患者IVF 治疗后的种植率（种植胚胎数/移植胚胎数）、解冻移植周期临床妊娠率（临床妊娠数/解冻移植周期数）及流产率（流产数/临床妊娠数），异位妊娠率（异位妊娠数/临床妊娠数），多胎率（多胎妊娠数/临床妊娠数），活产率（抱婴率）：有活产婴儿出生的分娩次数/移植周期数，以评估干预措施是否能改善POR 不孕症患者的妊娠结局。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0 软件对相关数据进行统计分析。计量资料符合正态分布者采用t检验，以均数±标准差表示；计数资料采用χ2检验，以频数（百分数）［例（%）］表示。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 安全性评价在治疗过程中观察组患者未发生不良反应。

2.2 观察组干预措施前后卵巢功能比较观察组治疗前后卵巢功能比较结果见表1。结果显示，治疗后基础AFC 显著高于治疗前（P= 0.002），基础FSH 显著低于治疗前（P= 0.011），AMH、基础LH及基础E2水平比较在治疗前后差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 观察组与对照组患者的临床基本资料、促排卵用药及胚胎情况比较两组患者的临床基本资料、促排卵用药及胚胎情况比较结果见表2。结果显示，女方年龄、体质量指数、AMH、AFC、基础FSH、基础LH 水平、促排卵天数及扳机日E2水平在两组中差异无统计学意义（P> 0.05），观察组患者基础E2水平显著低于B 组（P= 0.003），促性腺激素（gonadotropins，Gn）总量显著高于对照组（P=0.014）；A组患者的获卵数及可利用胚胎数均显著高于B组（P= 0.021、0.042）；两组患者的MII 卵数、受精率、卵裂胚胎数及优质胚胎数比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 观察组患者治疗前后卵巢功能比较Tab.1 The changes of ovarian function in observation group ±s

表1 观察组患者治疗前后卵巢功能比较Tab.1 The changes of ovarian function in observation group ±s

注：与治疗前相比较，aP<0.05

组别治疗前治疗后t 值P 值例数35 35 AMH（ng/mL）0.52±0.30 0.41±0.36 1.961 0.061基础AFC（个）2.82±1.98a 4.06±3.16-3.268 0.002基础FSH（IU/L）12.90±6.23a 10.19±4.10 2.676 0.011基础LH（IU/L）5.12±2.21 4.80±2.70 0.638 0.528基础E2（pmol/L）161.10±87.25 126.41±94.25 1.664 0.106

表2 观察组与对照组患者的临床基本资料、促排卵用药及胚胎情况比较Tab.2 Clinical features of patients,exogenous administration and embryo information of patientsin two groups±s

表2 观察组与对照组患者的临床基本资料、促排卵用药及胚胎情况比较Tab.2 Clinical features of patients,exogenous administration and embryo information of patientsin two groups±s

注：与B 组相比较，aP<0.05

指标女方年龄（岁）体质指数（kg/m2）AMH（ng/mL）基础AFC（个）基础FSH（IU/L）基础LH（IU/L）基础E2（pmol/L）t 促排（d）Gn 总量（IU）扳机日E2（pmol/L）获卵数（个）MII 卵数（个）受精率（%）卵裂胚胎数（个）可利用胚胎数（个）优质胚胎数（个）观察组（35 例）37.06±5.01 21.96±3.26 0.57±0.91 4.06±3.16 10.19±4.09 4.80±2.70 126.41±94.25a 9.77±3.25 1 628.5±617.76a 3 351.2±3 101.03 2.37±2.07a 1.97±1.44 87.0（60/69）1.51±1.31 1.43±1.271）0.68±1.02对照组（35 例）36.43±5.05 23.05±3.67 0.50±0.45 3.11±1.41 10.34±8.04 5.07±3.14 251.63±211.70 8.54±2.78 1 285.7±515.43 3 213.4±1 764.04 1.46±0.98 1.43±0.95 92.2（47/51）1.34±0.97 0.91±0.74 0.49±0.61 t 值0.523-1.314 0.399 1.611-0.098-0.370-3.118 1.698 2.520 0.226 2.358 1.858 0.821 0.621 2.072 0.993 P 值0.603 0.193 0.691 0.112 0.922 0.713 0.003 0.094 0.014 0.822 0.021 0.067 0.365 0.537 0.042 0.324

2.4 妊娠结局情况分析两组患者妊娠结局情况比较见表3。观察组35 例患者中6 例患者未获得可利用胚胎，5 例患者胚胎仍未解冻移植，24 例患者共进行了27 个解冻移植周期，临床妊娠12 例共12 个周期，其胚胎种植率为32.56%（14/43），解冻移植周期临床妊娠率为44.4%（12/27），流产率为16.7%（2/12），异位妊娠率为8.3%（1/12），多胎率为25%（3/12），活产率（抱婴率）为29.6%（8/27），仍有1 例现孕20+周，无异常。对照组35 例患者中7 例患者卵子未受精；3 例卵裂后胚胎质量差，无可利用胚胎；1 例患者胚胎未解冻移植；24 例患者共进行了24 个解冻移植周期，其中7 例患者获得临床妊娠，其胚胎种植率为27.3%（9/33），解冻移植周期临床妊娠率为29.2%（7/24），流产率为57.1%（4/7）（其中3 例孕早期胚胎停育行清宫术，1 例孕中期发现胎儿染色体异常行引产术），异位妊娠率为0（0/7），多胎率为42.8%（3/7），活产率（抱婴率）为12.5%（3/24）。

3 讨论

POR 是卵巢对Gn 刺激反应不良的病理状态，主要表现为卵巢刺激周期发育的卵泡少、血雌激素峰值低、Gn 用量多、周期取消率高、获卵数少和临床妊娠率低［5］。在辅助生殖促排卵过程中，POR发生率为9%～24%，临床妊娠率为10%～20%［6］，POR 已成为辅助生殖技术中的一个难点热点问题，目前尚无明确的干预措施可改善POR 患者的妊娠结局［7］。现代医学为了改善IVF 治疗效果，主要是通过加大Gn 用量，调整IVF 促排卵方案，促排卵前使用药物进行预处理如生长激素类药物［8］，脱氢表雄酮等，但尚无显著临床疗效［9-10］，由于POR 患者对Gn 的反应性差，获得优质卵子及胚胎的数量少从而导致较差的治疗结局，亦是目前辅助生育助孕中面临的棘手问题［11］。

表3 两组患者妊娠结局比较Tab.3 Pregnant outcome of patients in two groups %（例）

有研究显示中医治疗对于改善POR 患者效果显著［12］。尤昭玲等［13］针对卵巢低反应独创“冰山理论”提出了“望眼视巢”诊治法，针对使用拮抗剂方案的POR 患者给予分阶段二期三法治疗，有一定临床疗效。现代医学研究认为针刺信号可以通过穴位经外周神经传入中枢，调整下丘脑⁃垂体⁃卵巢轴，促进卵泡发育成熟、提高卵母细胞质量、从而改善卵巢功能［14］。LEE 等［15］通过对POR 患者进行的Ⅳ期针灸临床试验发现，促排卵前进行两个月经周期共16 次针灸治疗能显著改善POR 不孕患者的生活质量，并提高获卵数，认为此方案可能具有重要的临床价值。最近的一项多中心随机对照试验亦显示在促排卵前行针灸治疗三个周期可望成为POR不孕患者一种新的诊治方案［16］。XU等［17］通过对90 例POR 患者的随机对照研究发现，进行3 个月的经皮穴位电刺激组的基础内分泌、AMH水平、AFC、肾虚症状等方面得到明显改善，但对于其生育需求等方面未见报道。

虽然临床中已有将中药与传统针灸疗法应用于POR 患者，但结果仍有待进一步证实［18］。子午流注，是由中医针灸以“人与天地相应”的观点而来。子午流注穴位电刺激仪是在传统穴位电刺激仪的基础上结合子午流注的理论，将中医时间医学和现代物理治疗学有机结合开发而成的仪器，利用微电脑单片机技术，实现了子午流注与灵龟八法的精确时间计算，治疗时以电极片为介导作用于穴位，采用模拟针刺手法，具备多种刺激波形，可控制脉冲输出的强度和频率［19］。与传统针刺相比，子午流注穴位电刺激除了具有安全、无创、患者依从性好、经济有效等优点，还实现了子午流注与灵龟八法的精确时间计算，根据《黄帝内经》中人体穴位开合规律而定，利用穴位电极贴片代替毫针，利用电脉冲刺激代替传统针刺，调理人体内环境，平衡阴阳，打通经络治病。由于其采用择时选穴，定时取穴，同时可结合本研究中POR 患者的特点，时间与穴位相结合，按阴阳五行运用五腧穴，故在临床能取得较好的效果。文献研究发现，将子午流注穴位电刺激仪应用在POR 不孕症患者方面的研究尚缺乏，本研究首次将子午流注穴位电刺激仪结合辅助生育技术应用于POR 不孕症患者中，根据患者就诊时间选取相应的开穴进行治疗，以望为有生育需求的POR 患者寻求一条新的道路。

本研究结果表明，观察组治疗后AFC显著高于治疗前，且基础FSH 显著低于治疗前，差异有统计学意义。AFC 及基础FSH 是反应卵巢储备功能的两个重要指标，AFC 越高，基础FSH 越低则说明卵巢储备功能越好。因此本研究结果提示经子午流注穴位电刺激预处理后POR 患者的卵巢储备功能得到显著改善，此结果与焦娇等研究结果相符［17］。同时本研究发现，观察组促排卵中使用的Gn 总量显著高于对照组（P= 0.014），考虑与观察组患者的年龄偏高、卵巢储备功能低下有关。年龄是预测卵巢储备功能、评估卵子质量的重要指标之一。年龄越大，储备功能越差，所需要的Gn 药物则越多［20-21］。辅助生育治疗结局方面，本研究发现使用子午流注穴位电刺激后患者的获卵数及可利用胚胎数均显著高于对照组（P值分别为0.021 及0.042），观察组患者临床妊娠率（44.4%）及活产率（29.6%）均高于对照组（分别为29.2%，12.5%），但差异无统计学意义，考虑可能与子午流注穴位电刺激通过穴位刺激，改善了患者卵巢血供，进而增加获卵数及可利用胚胎数，改善了治疗结局。子午流注继承了传统针灸的优点，并在此基础上利用“人与天地相应”的观点，注重时间条件，以自然界周期现象，与人体气血周流的情况相配合。既避免了针刺疼痛，操作亦方便易于患者接受，又达到温通经络、活血化瘀、促进子宫及卵巢局部血液循环提高临床疗效的效果［22］。

综上所述，子午流注穴位电刺激能提高POR患者的卵巢储备功能，同时通过提高获卵数及可利用胚胎数获得较好的IVF 治疗结局，具有重要的临床研究价值。因本研究中样本例数偏少，临床妊娠率及活产率方面没有差异性提高，同时其具体作用机制亦有待于进一步大样本的临床研究，且可以尝试从基因表达、信号转导通路等方面进行更加深入的研究。