利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术及环介导等温扩增技术在结核性脑膜炎的诊断价值

冉燕 赵建军 张建勇 宗兆婧

遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科结核病区（贵州遵义563003）

我国是全球30 个结核病高负担国家之一，耐药结核病患者有增多趋势［1］，结核性脑膜炎作为最为严重的肺外结核病，严重者可致残或导致患者死亡［2-4］，目前临床上结核性脑膜炎诊断依赖于临床症状、脑脊液化验和头颅影像学检查，由于结核菌涂片阳性率低，且阳性可能为非结核分枝杆菌感染，结核菌培养周期长，头颅影像学早期改变无特异性，有时会造成漏诊、误诊等［5］，对结核性脑膜炎的诊断，尤其是早期诊断目前尚缺乏高效、简便的方法［6］。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert MTB/RIF）和环介导等温扩增技术（LAMP）为WHO 认证的可用于结核病诊断的新方法［7］，GeneXpert MTB/RIF 不但能检测出有无结核分枝杆菌，其还可判断有无利福平耐药基因突变，2 h 可获得结果，LAMP 是在等温条件下进行DNA 扩增，能快速检出结核菌，具有操作简单、耗时更短（50 min）、价廉等优势，两种方法均有学者进行研究［8-10］，但目前在结核性脑膜炎的诊断中未见脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和LAMP 两种实验室方法比较的相关报道，现回顾性分析我科110例结核性脑膜炎患者，探讨脑脊液GeneXpert MTB/RIF 及脑脊液LAMP 检测两种方法对结核性脑膜炎的早期诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象2016年12月至2019年12月在我院呼吸与危重症医学科结核病区和神经内科住院患者，纳入110 例临床诊断为结核性脑膜炎的患者为结核性脑膜炎组，年龄均≥14 周岁且符合《结核性脑膜炎临床诊断专家共识》［11］及《2019 中国中枢神经系统结核病诊疗指南》［12］诊断标准，除外妊娠、糖尿病、HIV 感染及免疫缺陷患者，所有患者无抗结核化疗病史，院外未降颅内压治疗。结核性脑膜炎合并血行播散性肺结核患者43 例，合并继发性肺结核58 例，单纯结核性脑膜炎患者9 例。110 结核性脑膜炎患者随机分为A 组和B 组，其中A 组男43 例，平均年龄（55.41±16.07）岁；女17 例，平均年龄（33.19 ± 15.18）岁，B 组男31 例，平均年龄（40.34 ± 18.14）岁；女19 例，平均年龄（40.94 ±20.74）岁，CG 组20 例（诊断为病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎）为对照组，诊断标准参考第8 版《神经病学》［13］。三组患者入院后行头颅MRI，签署知情同意书后A 组行腰椎穿刺术抽脑脊液共22 mL 分别查脑脊液常规、生化、结核菌涂片、结核菌培养、GeneXpert MTB/RIF，B 组同样抽脑脊液22 mL 送脑脊液常规、生化、结核菌涂片、结核菌培养、LAMP，CG 组同样抽脑脊液24 mL送脑脊液常规、生化、结核菌涂片、结核菌培养、GeneXpert MTB/RIF 和LAMP。脑脊液常规、生化和结核菌涂片均在我院检验科完成，脑脊液结核菌培养、GeneXpert MTB/RIF 及脑脊液LAMP 在我科呼吸医学研究室完成。

1.2 方法

1.2.1 涂片抗酸染色法检测脑脊液中的抗酸杆菌取脑脊液标本1 mL，抗凝后离心10 min，弃上清，取沉渣均匀涂抹于玻片2/3 处，将玻片置于染色架上，用火焰固定，滴加石碳酸复红染液，盖满玻片，加热至出现蒸汽后脱离火焰，保持5 min，轻缓冲洗，沥水，滴加脱色液，保持1 min，再滴加亚甲蓝溶液染色30 s，最后水洗干燥后进行镜检，用显微镜读片观察300 个视野后报告结果。

1.2.2 罗氏培养法检出脑脊液中的结核分枝杆菌取脑脊液5 mL，抗凝后离心10 min，弃上清，取沉渣2 ～3 滴接种于2 支培养基斜面上，置37 ℃温箱培养，分别在第3 天和第7 天各观察1 次，此后需每周观察1 次，有菌落生长需经抗酸染色确认后报告，至第8 周无菌落生长则报告为阴性。当结果为阳性时，再采用对硝基苯甲酸鉴定菌落为非结核分枝杆菌或结核分枝杆菌。

1.2.3 脑脊液GeneXpert MTB/RIF 检测方法取脑脊液8 mL，抗凝后离心10 min，弃上清，取沉淀置于前处理管中，加入GeneXpert MTB/RIF 处理液，剧烈摇动10 ～20 次，室温放置15 min，一次移液管取2 mL 处理后样品由加样孔缓慢加入Cartidge 反应盒内，打开电脑和GeneXpert MTB/RIF 检测仪，运行GeneXpert MTB/RIF 操作软件，仪器自检结束后开始测试，待测试结束后读取结果。

1.2.4 脑脊液LAMP 检测方法取脑脊液8 mL，离心后取60 μL 至加热管，90 ℃加热5 min，取出吸附管置于吸附架上，勾住吸附管帽环向上提起打开吸附管，将加热管底部旋入吸附管顶端，震动充分混匀，将吸附管的注射帽放在盖子里，倒置吸附管，加反应液至两刻度线之间，将帽环套住纯化装置尖端，丢弃装置，取毛细管插紧上端后插入阳性对照，吸取液体至刻度线，将其挤入到LAMP 反应管内，握紧底端将全部反应液体甩到盖子上，倒置2 min，使干燥的LAMP 试剂与反应液充分混合，上下翻转使充分混匀，当反应模块温度达到67 ℃开始LAMP 反应，反应结束后，取出反应管并放入荧光检测模块，记录反应结果。

1.3 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差表示，统计学方法采用χ2检验和t检验，以P< 0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核性脑膜炎A 组患者和B 组患者脑脊液细胞学检测结果比较结核性脑膜炎A 组和结核性脑膜炎B 组患者腰椎穿刺术测脑脊液压力，送脑脊液常规及生化检查，提示仅脑脊液蛋白两组之间存在统计学差异，而脑脊液压力、白细胞计数、氯化物、葡萄糖、ADA、LDH 两组之间差异均无统计学意义。见表1。

表1 结核性脑膜炎A 组患者和B 组患者脑脊液细胞学检测结果比较Tab.1 Comparison of CSF cytological test results between group A and group B in patients with tuberculous meningitis±s

表1 结核性脑膜炎A 组患者和B 组患者脑脊液细胞学检测结果比较Tab.1 Comparison of CSF cytological test results between group A and group B in patients with tuberculous meningitis±s

组别A 组B 组t 值P 值压力235.39±95.32 218.48±85.99 0.860 0.394脑脊液蛋白3 205.48±2 125.13 3 187.70±2 217.71 2.356 0.532白细胞计数591.67±1 472.71 453.00±1 298.64 1.822 0.068氯化物112.18±10.48 116.09±9.89 1.784 0.080葡萄糖1.65±1.63 2.15±1.12 1.582 0.121 ADA 7.97±4.88 6.02±4.92 1.891 0.064 LDH 106.16±76.99 87.75±78.47 1.122 0.267

2.2 结核性脑膜炎组和CG组脑脊液检测结果结核性脑膜炎A 组60 例患者结核菌涂片阳性5 例，阳性率8.3%，结核菌培养10 例，阳性率16.7%，脑脊液GeneXpert MTB/RIF 阳性32 例，阳性率53.0%，利福平耐药基因检测阳性3 例。结核性脑膜炎B组50 例患者结核菌涂片阳性4 例，阳性率8.0%，结核菌培养9 例，阳性率18.0%，脑脊液LAMP 阳性29 例，阳性率58.0%。CG 组结核菌涂片、结核菌培养和脑脊液GeneXpert MTB/RIF、LAMP 检测结果均为阴性。

2.3 结核性脑膜炎A 组、B 组和CG 组组间结果比较结核性脑膜炎A 组和CG 组脑脊液GeneXpert MTB/RIF对比差异有统计学意义（χ2=17.78，P=0.00）；结核性脑膜炎B 组和CG 组脑脊液LAMP 间差异有统计学意义（χ2=19.81，P=0.00）；结核性脑膜炎A 组和结核性脑膜炎B 组脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 阳性率对比差异无统计学意义（χ2=0.24，P=0.62）。

2.4 脑脊液蛋白1 000 mg/L以上和1 000 mg/L以下患者脑脊液GeneXpert MTB/RIF和LAMP结果脑脊液蛋白1 000 mg/L 以上患者结核性脑膜炎A 组和B 组分别为40 例和28 例，A 组脑脊液Gen⁃eXpert MTB/RIF 阳性20 例，阳性率50.0%，B 组脑脊液LAMP 阳性15 例，阳性率53.6%。脑脊液蛋白1 000 mg/L 以下结核性脑膜炎A 组和B 组分别为20 例和22 例，A 组脑脊液GeneXpert MTB/RIF 阳性12 例，阳性率60.0%，B 组脑脊液LAMP 阳性14 例，阳性率63.6%。

3 讨论

结核性脑膜炎是结核分枝杆菌感染引起的中枢神经系统非化脓性炎性疾病，其发病率、致残率和病死率高［14-15］，其预后与早期诊断、早期治疗密切相关［14］，但早期诊断有一定的难度，目前实验室方法有局限性，无法满足对结核性脑膜炎早期、快速诊断的要求，近年来分子生物学技术开始被关注［16-18］，本研究探讨两种分子生物学技术（脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和LAMP）在结核性脑膜炎中的早期诊断价值。

本研究纳入110 例结核性脑膜炎患者，随机分为结核性脑膜炎A 组和结核性脑膜炎B 组，两组脑脊液细胞学检测结果差异无统计学意义，A 组进行脑脊液结核菌涂片、结核菌培养和脑脊液GeneXpert MTB/RIF 检查，结果表明脑脊液GeneX⁃pert MTB/RIF 阳性率远高于结核菌涂片、结核菌培养，脑脊液GeneXpert MTB/RIF结果提示其中有3例患者脑脊液利福平耐药基因检测为阳性，该3 例患者结核菌培养结果有2例为阳性，利福平耐药，表明脑脊液GeneXpert MTB/RIF 不仅能早期判断有无结核分枝杆菌感染，同时还能判断有无利福平耐药，指导临床用药。另1例结核菌培养为阴性，其原因分析可能是：（1）传统药敏结果受接种技术、培养基质量、孵化时间、药物耐药临界浓度等多种因素影响；（2）不排除该例患者是菌群中同时存在敏感菌和耐药菌的结合；（3）送检的结核菌培养和脑脊液GeneXpert MTB/RIF 为非同一份标本，结果可能存在不一致。而脑脊液LAMP 相对于GeneXpert MTB/RIF 检测需要的时间更短，技术要求不高，价格相对低廉，故将结核性脑膜炎B 组进行结核菌涂片、结核菌培养，脑脊液LAMP 检查，同样脑脊液LAMP 阳性率也远高于结核菌涂片、结核菌培养。本课题脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP对结核性脑膜炎的诊断阳性率均能达到53%和58%，可能和送检量大（8 mL）有关，有文献报道高容量的脑脊液能有效提高诊断阳性率［19-20］。同时还选取20 例临床诊断为化脓性脑膜炎、病毒性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎的患者进行脑脊液GeneX⁃pert MTB/RIF 及LAMP 检测，结果20 例患者脑脊液结核菌涂片、结核菌培养、GeneXpert MTB/RIF 及LAMP 全为阴性。以上结果揭示脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 均是早期诊断结核性脑膜炎较好的实验室方法，特异性好，敏感性高，两种检测耗时均短（分别耗时2 h 及50 min），优于目前常规检测手段，可以作为早期诊断结核性脑膜炎的可靠指标。

结核性脑膜炎患者在脑膜发生炎症的情况下，血脑屏障受损，通透性增高，进入脑脊液的蛋白量升高［21］，故脑脊液蛋白对结核性脑膜炎的诊断有较大的参考价值，脑脊液蛋白越高提示脑膜损坏越严重，结核菌繁殖越旺盛，有文献报道脑脊液蛋白含量升高的程度为影响结核性脑膜炎早期诊断的独立因素［22］。大多数结核性脑膜炎患者脑脊液蛋白在1 000 mg/L 以上，本研究分析未抗结核化疗前脑脊液蛋白在1 000 mg/L 以上和1 000 mg/L以下患者的脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 的阳性率，实验结果提示即使在脑脊液蛋白1 000 mg/L 以下，脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 的阳性率仍可达到60.0%和63.6%，远高于脑脊液结核菌涂片和结核菌培养，提示在脑脊液表现不典型的情况下脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 对临床结核性脑膜炎的早期确诊提供了实验室诊断依据。

综上所述，脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 两种技术对结核性脑膜炎的诊断阳性率高，且耗时短，能早期获得结果，对结核性脑膜炎的诊断有重要价值，但两者各有优势，故建议在经济比较发达地区，可选择脑脊液GeneXpert MTB/RIF 或LAMP 检测有效提高诊断阳性率，但在基层医院或经济贫困地方可先行脑脊液LAMP，若临床高度怀疑耐药的患者仍可选择脑脊液GeneXpert MTB/RIF。本研究标本数量偏少，接下来拟扩大标本量进一步对同一份标本进行脑脊液GeneXpert MTB/RIF 和脑脊液LAMP 检查，希望能更进一步提高结核性脑膜炎早期诊断率，早期指导治疗和改善患者预后。