超声、细针穿刺细胞学及BRAFV600E基因对甲状腺结节的诊断价值

赵媛 赵永刚 张春芳 陈昊 张智弘

1南京医科大学临床医学院连云港市第一人民医院（江苏连云港222002）；2南京医科大学第一附属医院（南京210029）

甲状腺结节是甲状腺最常见的疾病之一，在人群中的发生率为20% ～76%，其中恶性结节占5%～15%［1-2］；甄别甲状腺结节的良恶性及其生物学行为，进而做出正确的临床决策是临床的首要任务和当前研究的热点之一。

超声（ultrasound，US）在甲状腺结节良恶性鉴别诊断中具有不可替代的优势，是首选检查方法。以此为基石，超声引导下细针穿刺细胞学（fine⁃needle aspiration cytology，FNAC）是术前诊断甲状腺结节良、恶性的“金标准”，其使用Bethesda 报告甲状腺细胞病变系统，该报告系统分级明确，有助于改善患者管理，亦存在一定局限性，其中19.7% ～30%无法明确诊断［3-5］。2015年美国甲状腺协会（ATA）指南建议使用分子标志物来进一步诊断和管理不确定结节。近年来，分子标志物大量应用到术前FNAC 检测中，BRAFV600E是当前研究热点之一，大约40% ～83%的PTC 存在BRAFV600E突变，其诊断PTC 的阳性预测值接近100%，称其是PTC 的特异性标记物［6］。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2015年1月至2018年12月在南京医科大学第一附属医院经US 检查同时行FNAC、BRAFV600E基因突变检测并且有术后病理的512 例甲状腺结节病例资料，包括61 例良性病变和451 例甲状腺恶性肿瘤，入选病例中男122 例，女390 例，年龄17 ～77 岁，平均（43.4±12.4）岁，结节最大直径3 ～73 mm，平均（13.3±9.4）mm。

1.2 方法

1.2.1 超声检查常规描述甲状腺影像和报告系统（the thyroid imaging reporting and data system，TIRADS）分类中的五个方面：结构、回声水平、形态、边缘和钙化，同时描述结节位置、大小、数量、血供情况、与周围被膜组织的关系，以及评估颈部淋巴结情况，根据TIRADS 分类将结节分为6 类。

1.2.2 细针穿刺细胞学检查超声探查目标结节，确定穿刺路径；局部0.5%碘伏消毒，戴无菌手套，左手固定结节，右手在超声引导下将带5 mL针筒的25G 穿刺针沿预定路线刺入结节内，反复抽吸3 次左右，将注射器内穿刺物打入BD 公司一次性保存液中并反复抽吸几次，送至病理科，使用BD 公司沉降式液基细胞自动制片设备进行制片和巴氏染色，后透明、封片和镜检。

1.2.3 BRAFV600E基因突变检测取材方法同细针穿刺细胞学，将注射器内穿刺物打入BD 公司一次性保存液中，送至病理科分子室后转移到装有裂解液的EP 管中，采用扩增阻滞突变系统多聚酶链式扩增法检测BRAFV600E基因突变结果。

1.3 结果判读

1.3.1 超声结果判读术前超声评估甲状腺结节均按照KWAK 等［7］提出的甲状腺影像和报告系统分为6类。TIRADS 1类：正常甲状腺；TIRADS 2类：良性甲状腺结节；TIRADS 3 类：可能良性甲状腺结节；TIRADS 4A 类：低度可疑恶性结节；TIRADS 4B类：中度可疑恶性结节；TIRADS 4C 类：高度可疑恶性结节；TIRADS 5 类：典型恶性征象；TIRADS 6类：已行活检并有恶性病理诊断。

1.3.2 细胞学结果判读细针穿刺细胞学按照2007年美国国家癌症协会制定的Bethesda 报告甲状腺细胞病变系统进行报告，将诊断结果分为6 类：Ⅰ类：标本无法诊断或不满意；Ⅱ类：良性病变；Ⅲ类：意义不明确的细胞非典型病变/滤泡性病变；Ⅳ类：滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤；Ⅴ类：可疑恶性肿瘤；Ⅵ类：恶性肿瘤。

1.3.3 BRAFV600E 基因突变结果判读若样本的FAM 信号Ct 值≥28，则样本为阴性（BRAFV600E野生型）；若样本的FAM 信号Ct 值< 28，则样本为阳性（BRAFV600E突变型）。

1.3.4 联合诊断结果判读联合诊断时，几种方法均诊断为良性，则判定为良性；若诊断不一致，则其中一种诊断为恶性，即判定为恶性。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。以术后病理为金标准，构建US、FNAC、BRAFV600E及不同联合诊断方法的ROC 曲线，联合诊断使用二元Logistic 回归分析计算联合预测因子；通过ROC 曲线确定US 和FNAC 的最佳截断点并计算AUC，比较不同方法的诊断效能；计数资料组间比较采用行×列卡方检验；计量资料以均数±标准差表示。P<0.05 时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后切除512 例甲状腺结节US、FNAC 及BRAFV600E突变测定结果512 例结节的US 诊断结果（表1）：TIRADS 3 类结节23 个，其中恶性2 例；TIRADS 4A 类结节100 个，其中恶性72 例；TIRADS 4B类结节146个，其中恶性136例；TIRADS 4C类结节171个，其中恶性169例；TIRADS 5类结节72个，均为恶性；FNAC 诊断结果（表2）：Bethesda Ⅰ类结节27 个，其中4 例术后被诊断为PTC；BethesdaⅡ类结节25 个，其中1 例被诊断为PTC；BethesdaⅢ类结节42 个，其中29 例被诊断为PTC，1 例为滤泡癌（follicular thyroid carcinoma，FTC），1 例为髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）；Bethesda Ⅳ类结节6 个，其中4 例被诊断为FTC；Bethesda Ⅴ类结节133 个，其中恶性132 例，包括126 例PTC，2 例淋巴瘤，1 例FTC，1 例MTC，1 例未分化癌，1 例嗜酸细胞癌；Bethesda Ⅵ类结节279 个，均被诊断为PTC；BRAFV600E诊断结果（表3）：BRAFV600E野生型78 例，其中恶性19 例，包括8 例PTC，5 例FTC，2 例MTC，2 例淋巴瘤，1 例未分化癌，1 例嗜酸细胞癌；BRAFV600E突变型434 例，其中被诊断为PTC 431 例，FTC 1 例。

2.2 比较US、FNAC 及BRAFV600E突变检测及不同方法联合的诊断效能构建三种诊断方法及不同联合诊断方法的ROC 曲线（图1），ROC 曲线表明US 的最佳诊断截断点是4B，即TIRADS 1⁃4A 类为良性，TIRADS 4B⁃6 类为恶性；FNAC 的最佳诊断截断点是Ⅴ，即BethesdaⅠ⁃Ⅳ类为良性，BethesdaⅤ⁃Ⅵ类为恶性；以术后病理为标准，US 诊断甲状腺恶性肿瘤的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和AUC 分别为83.59%、80.33%、96.92%、39.84%和0.888；FNAC 诊断对应的指标分别为91.13%、98.36%、99.76%、60.00%和0.980；BRAFV600E基因检测为95.79%、96.72%、99.54%、75.64%和0.963；US+FNAC 诊断为94.46%、80.33%、97.26%、66.22% 和0.986；FNAC+BRAFV600E基因检测为98.45%、96.72%、99.55%、89.39%和0.995；三种诊断方法联合的指标分别为98.89%、78.69%、97.17%、90.57%和0.993（表4）。

表1 TIRADS 分类结果与术后结果比较Tab.1 Comparison of TIRADS classification results with postoperative results 例

表2 Bethesda 报告结果与术后结果比较Tab.2 Comparison between the results reported by Bethesda and postoperative results例

表3 BRAFV600E检测结果与术后结果比较Tab.3 Comparison of BRAFV600E detection results and postoperative results 例

图1 US、FNAC、BRAFV600E及不同联合诊断方法的ROC曲线Fig.1 ROC curves of US，FNAC，BRAFV600E and differentcombined diagnostic methods

表4 US、FNAC、BRAFV600E及不同联合诊断方法的诊断效能Tab.4 Diagnostic efficacy of US，FNAC，BRAFV600E and different combined diagnostic methods

2.3 FNAC、BRAFV600E 突变检测与术后病理结果比较BethesdaⅠ⁃Ⅳ类共100 例，其中BRAFV600E突变率35%（35/100），BethesdaⅠ⁃Ⅳ类恶性率为40%；BethesdaⅤ⁃Ⅵ类共412 例，其中BRAFV600E突变率96.84%（399/412），BethesdaⅤ⁃Ⅵ类恶性率为99.76%；512 例标本中BRAFV600E 基因突变型434 例，占84.77%；野生型78 例，占15.23%（表5）。

2.4 US、FNAC、BRAFV600E与FNAC联合BRAFV600E突变检测诊断率的比较US 诊断阳性病例389例，阴性病例123 例；FNAC 诊断阳性病例412 例，阴性病例100 例；BRAFV600E诊断阳性病例434 例，阴性病例78 例；FNAC 联合BRAFV600E诊断阳性病例446 例，阴性病例66 例；FNAC 联合BRAFV600E诊断优于单独US，差异有统计学意义；两者联合诊断亦优于单独FNAC（表6）。

表5 FNAC、BRAFV600E与手术病理结果比较Tab.5 Comparison of FNAC，BRAFV600E and surgical pathological results 例

表6 US、FNAC、BRAFV600E 与两者联合诊断的比较Tab.6 Comparison of US，FNAC，BRAFV600E and their combined diagnoses 例

3 讨论

CHEN 等［8］进行流行病学统计显示2000年至2011年我国甲状腺癌的发病率由4.9%上升到20.1%，是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。术前鉴别甲状腺结节良恶性的方法有很多，超声是最便捷、最经济的方法，KWAK 等［7］提出五个恶性特征对其进行分类，尽管这些特征具有较高的特异性，但敏感性相对较低；FNAC 是在超声引导下通过细针对结节进行穿刺诊断的方法，具有创伤小、效率及准确性高等特点［9］，但其中约10% ～40%的结节受大小、位置、穿刺及病理医生的经验水平等影响而不能明确诊断［10］；BRAFV600E作为PTC 的特异性标记物，FNAC 基础上进一步检测BRAFV600E可确诊部分无法明确性质的结节［11-12］。本文以术后病理为标准，比较US、FNAC、BRAFV600E及联合诊断对甲状腺结节的诊断价值。

本研究结果显示US 诊断甲状腺恶性肿瘤的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为83.59%、80.33%、96.92%、39.84%，与MISTRY 等［13］研究相比，其阳性预测值偏高而阴性预测值偏低，显示出影像科医生对于恶性特征把握太紧，判断相对保守；FNAC 诊断甲状腺恶性肿瘤的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为91.13%、98.36%、99.76%和60.00%，阴性预测值明显偏低，原因为Bethesda Ⅲ和Ⅳ类恶性率明显偏高；WU 等［14］根据细胞形态学将Bethesda Ⅲ类分为四个亚组：AUS 未指定、AUS 不能排除滤泡性肿瘤、AUS 不能排除Hurthle 细胞肿瘤和AUS 不能排除PTC，这四个亚型的恶性肿瘤风险分别为44%、81%、53%及63%。本文Bethesda Ⅲ类恶性率高的主要原因是细胞诊断医生使用较多“AUS 不能排除PTC”的诊断术语；Bethesda Ⅳ类恶性率高是细针穿刺细胞学的局限性造成的，滤泡性肿瘤与滤泡性癌的鉴别要点在于是否存在包膜或血管的侵犯，仅仅细针穿刺细胞学很难对这两类肿瘤进行鉴别诊断［15］；本研究经术后证实PTC 共439 例，其中431 例发生BRAFV600E突变；其他类型恶性肿瘤共12例，仅有1例FTC 发生BRAFV600E突变；上述结果显示BRAFV600E检测对PTC 的诊断意义较大，对其他类型恶性肿瘤帮助不大，由于甲状腺恶性肿瘤中约99%为PTC［16］，因此BRAFV600E对甲状腺结节仍然具有很高的诊断价值。

通过绘制ROC 曲线，显示FNAC 联合BRAFV600E的AUC 最大，诊断效能最高，敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为98.45%、96.72%、99.55%、89.39%。BEIŠA 等［17-20］报道FNAC 联合BRAFV600E基因检测可改良单独FNAC 的诊断效能。本研究中BethesdaⅠ类发生率为5.27%，其中BRAFV600E突变率为18.52%，恶性率为14.81%；Bethesda Ⅲ类发生率为8.20%，其中BRAFV600E突变率为69.05%，恶性率为73.81%；由此可以看出，BRAFV600E检测可以明确诊断FNAC 中性质不确定的大部分结节，从而减少不必要的外科手术［21-22］；术后病理诊断为其他类型恶性肿瘤12 例，其中BRAFV600E突变仅1 例，而FNAC 诊断Bethesda Ⅴ类5 例，Bethesda Ⅳ类4 例，Bethesda Ⅲ类2 例，并且给出了倾向性肿瘤类型，可见FNAC 可以降低BRAFV600E的假阴性率，两者相互补充，显著提高了诊断性能。

综上所述，US 对甲状腺恶性肿瘤有良好的预测作用，可以筛选出高危甲状腺结节，进而进一步行细针穿刺和基因诊断。FNAC 联合BRAFV600E可提高术前甲状腺良恶性结节的诊断。本研究亦存在局限性，总样本中良性标本比例偏低，可能存在一定的选择偏倚，期待后期扩充样本量进行深入研究探讨甲状腺结节术前最佳诊断方法，为患者管理和临床决策提供更科学的依据。