861例卵巢高反应患者全胚冷冻后首次FET时间探讨

吴静，李博，黄剑磊

(空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038)

在控制性卵巢刺激(COS)过程中，卵巢对常规剂量的外源性促性腺激素的过度反应称为卵巢高反应，在辅助生殖技术(ART)周期中发生率为3%～8%，通常表现为大量卵泡的募集、发育，体内雌激素水平快速升高，导致全身应激状态的变化[1]，特别是显著增加卵巢过度刺激综合征(OHSS)的风险，严重者危及生命。同时高水平雌孕激素因影响子宫内膜容受性而影响体外受精-胚胎移植(IVF-ET)新鲜周期的妊娠结局[2]。随着玻璃化冷冻技术的发展与成熟，为避免OHSS发生同时改良妊娠结局，全胚冷冻行冻融胚胎移植(FET)成为卵巢高反应患者既安全又有效的措施之一。然而高反应患者远超生理水平的雌激素对子宫内膜容受性的影响何时能恢复？且此类患者获卵数多，取卵术后卵巢内含多个血体、体积大，因此，何时行FET既安全又能获得更优的妊娠结局成为临床上经常面临的问题。查阅国内外文献，相关报道较少，且多数研究对象为卵巢正常反应人群，而针对高反应患者的研究更加缺乏。本文通过对全胚冷冻后不同月经周期行首次FET的861例高反应患者进行回顾性分析，旨在探讨卵巢高反应患者获益最大的首次FET时间，为临床医生提供参考。

资料与方法

一、研究对象与分组

选取2016年1月1日至2018年12月31日在空军军医大学唐都医院生殖医学中心进行IVF-ET治疗的不孕患者为研究对象。纳入标准：(1)年龄<35岁；(2)卵巢高反应(促排卵中发育卵泡数>20个，E2峰值>14 640 pmol/L和/或获卵数>15个)[3]并全胚冷冻；(3)已完成首次FET；(4)子宫内膜准备方案为自然周期(NC)、诱发排卵周期(OI)或者激素替代周期(HRT)。排除标准：(1)BMI≥28 kg/m2；(2)输卵管积水；(3)子宫腺肌病、子宫畸形、宫腔粘连；(4)甲状腺或肾上腺功能异常；(5)自身免疫性疾病。

最终本次研究纳入861个周期(861例患者)，根据取卵术后首次行FET的时间分为3组：A组为取卵术后第1次月经周期行FET(n=140)；B组为取卵术后第2次月经周期行FET(n=415)；C组为取卵术后≥第3次月经周期行FET(n=306)。

二、研究方法

1.控制性促排卵方案、取卵及胚胎冷冻：促排方案选取激动剂长方案或拮抗剂方案。激动剂长方案研究对象使用GnRH-a于黄体中期降调节，达到降调标准后根据年龄、BMI、基础性激素水平及窦卵泡数决定注射用重组人促卵泡素(果纳芬，默克雪兰诺，瑞士)启动剂量，促排过程中根据卵巢反应进行Gn剂量调整。拮抗剂方案从月经第2～4天始给予Gn启动促排卵，促排卵第5～6天开始添加注射用醋酸西曲瑞克(思则凯，默克雪兰诺，法国)。当有2个卵泡直径达18 mm或3个卵泡直径达到17 mm时，当晚扳机，35～37 h后在阴道B超引导下穿刺取卵，根据男方取卵日精液情况决定受精方式，胚胎均进行快速玻璃化冷冻方法进行冷冻保存。

2.胚胎评分：根据文献标准[4]，卵裂期胚胎质量评分：Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整；胞质均匀清晰，无颗粒现象；碎片0%～5%。Ⅱ级：卵裂球大小略不均匀，形态略不规则，胞质内可见颗粒现象；碎片6%～20%。Ⅲ级：卵裂球大小明显不均匀，可有明显的形态不规则；胞质内颗粒现象明显；碎片21%～50%。Ⅳ级：卵裂球大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象；碎片>50%。D3的Ⅰ级和Ⅱ级7～9细胞视为优质胚胎。采用Gardner等[5]方法认为评分≥3BB的囊胚为优质囊胚。

3.FET内膜准备方案及黄体支持：①自然周期(NC)：适用于月经周期正常、有规律排卵者。从月经第10～12天开始B超监测卵泡大小及子宫内膜情况。根据LH峰出现时间及排卵后孕酮水平确定移植时间，排卵后给予口服黄体酮胶囊(益玛欣，浙江仙琚)100 mg，2次/日，直到移植日后15 d，移植D3卵裂期胚胎或移植D5囊胚。②诱发排卵周期(OI)：适用于月经周期不规律，排卵障碍者，月经第5天始给予注射用尿促性素(乐宝得，珠海丽珠)50～75 U/d，连用5～7 d后测卵泡大小、内膜情况及激素水平，若卵泡小内膜仍较薄，继续给药3～5 d。若卵泡直径≥18 mm时仍未出现LH峰，则肌肉注射绒促性素(HCG，珠海丽珠)5 000～10 000 U。LH峰后24 h或HCG日后36 h给予口服黄体酮胶囊100 mg，2次/d，直到移植日后15 d，移植同上。③激素替代周期(HRT)：适用于月经周期不规律、子宫内膜较薄者。月经周期第3天开始口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜尔，德国)2 mg，1次/d，连续3 d后改为 2次/d，连续3 d，最后3次/d，连续3 d，共9 d。若子宫内膜厚度<7 mm，则继续口服戊酸雌二醇2 mg，3次/d，3～6 d；内膜厚度≥7 mm时，给予黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺酮，默克雪兰诺，瑞士)每日一枚，联合肌肉注射黄体酮注射液(浙江仙琚)20 mg，1次/d，转化内膜。内膜转化的第4天移植卵裂期胚胎，第6天移植囊胚。

4.妊娠判断：移植术后第13～15天查血β-HCG，β-HCG>10.0 U/L为HCG阳性。HCG阳性者在移植术后28～30 d首次经阴道B超了解宫内是否可见孕囊，有孕囊者诊断为临床妊娠，同时核实孕囊数目。

5.观察指标：主要观察指标为临床妊娠率、自然流产率及活产率，次要观察指标为胚胎种植率、卵巢径线均值、盆腔积液阳性患者占比、卵巢内含血体患者占比及早孕期并发症。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎种植率=孕囊数/总移植胚胎数×100%；活产率=活产分娩数/移植周期数×100%；自然流产率=自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%；卵巢径线均值=(长径线+横径线)/2。

三、统计学方法

结 果

一、患者一般情况比较

统计结果显示，3组患者的年龄、不孕年限、BMI、不孕类型、AMH水平及每组多囊卵巢综合征(PCOS)患者占比等比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 三组患者一般情况比较[(-±s)，n(%)]

二、患者促排卵及胚胎培养情况比较

3组患者的促排方案、HCG日E2水平、受精方式、获卵数、受精率、可用胚胎数及优质胚胎数等比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 三组患者促排卵及胚胎培养数据比较[(-±s)，n(%)]

三、患者FET周期临床数据比较

患者双侧卵巢大小表现为A组>B组>C组，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢内含血体患者占比及妇科超声提示盆腔液体阳性患者占比随行FET时间的延后而逐渐显著下降(P<0.05)。A组子宫内膜准备方案中NC及OI方案占比均显著低于B、C两组(P<0.05)，HRT方案占比显著高于B、C两组(P<0.05)，而三种方案的占比在B组与C组间无显著性差异(P>0.05)。3组患者间移植日子宫内膜厚度及移植胚胎数均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 三组患者FET周期临床数据比较[(-±s)，n(%)]

四、患者FET周期妊娠结局比较

统计结果显示，3组患者间临床妊娠率、胚胎种植率、自然流产率及活产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表4)。并发症方面，A组出现卵巢不全扭转3例，其中2例经手法复位后好转，1例患者下腹痛急诊入院后行经阴道超声引导下卵巢囊肿穿刺抽吸术后好转，3例患者卵巢平均径线均>80 mm，内含多个血体与囊肿(非赘生性)；B组及C组中均未统计到类似病例。

表4 三组患者FET周期妊娠结局比较(%)

讨 论

卵巢高反应的诊断标准通常用获卵数和/或HCG日E2水平来界定，但具体cut-off值尚无定论。外文文献[6-7]中定义高反应为：获卵数>13～18个和/或E2水平>11 010～18 300 pmol/L。我国2018年中华医学会专家共识[3]中的诊断标准：在促排卵中发育卵泡数>20个、E2峰值>14 640 pmol/L和/或获卵数>15个。可见无论国内外，卵巢高反应人群均为高雌激素水平及高获卵数。促排卵过程中，中、重度OHSS平均发生率为3%～6%，而在卵巢高反应人群中发生率可高达14%～16%[8]。如何预防和降低中、重度OHSS发生率成为高反应人群面临的严峻问题之一。

随着胚胎玻璃化冷冻技术的发展与成熟，FET成为IVF/ICSI-ET过程中不可或缺的重要技术。研究表明，FET周期复苏后的胚胎质量及种植潜能与新鲜胚胎移植周期几乎无差别[9]，而种植率、临床妊娠率及继续妊娠率相较于新鲜移植周期更优[10]。2016年Chen等[11]研究证实，作为卵巢高反应高危人群之一的PCOS患者，FET周期较新鲜周期移植能获得更高的活产率和更低的流产率，同时避免了OHSS的威胁，认为PCOS人群采用全胚冷冻+FET策略获益更多。究其原因，促排卵过程中特别是卵巢高反应患者过多卵泡的发育及募集导致血中远超生理水平的雌激素及异常的雌孕激素比例，影响子宫内膜上生物活性因子的表达，使内膜提前向分泌期转化，内膜胚胎发育不同步[12]，同时促排卵增加内膜的自然杀伤细胞，打破子宫母胎界面的免疫平衡[13]，从而降低新鲜胚胎移植的妊娠结局。而FET周期更接近生理水平的激素浓度，能在避免OHSS的同时显著降低这种负面影响。

然而取卵术后子宫内膜容受性的恢复时间是怎样？若短时间内移植，未恢复的卵巢是否会影响妊娠结局并出现并发症？2017年的一项回顾性分析[14]显示：新鲜周期移植失败后，首次FET时间延迟组的胚胎种植率、临床妊娠率及活产率显著优于非延迟组，认为高雌、孕激素水平对子宫内膜容受性的不利影响具有持续性，取卵术后需推迟一个月经周期(即≥第2个月经周期)再行FET更佳。但很多研究结果[15-17]显示，无论新鲜周期是否移植，无论促排卵方案是长方案或是拮抗剂方案，FET延迟组与非延迟组妊娠结局均无统计学差异，认为月经来潮一次子宫内膜容受性即可恢复。但上述研究均未将患者分类分析，对于卵巢高反应患者，HCG日更高的雌激素水平，是否对子宫内膜容受性的不利影响更大、作用时间更持久，都缺乏相应的研究报道。本文研究结果显示：卵巢高反应患者取卵术后第1、2或≥3个月经周期移植，其临床妊娠率、胚胎种植率、自然流产率及活产率结局均无显著性差异(P<0.05)，即HCG日雌激素水平高低并不影响月经来潮后子宫内膜容受性的恢复，与2019年张春晓等[18]的研究结果一致。

与其他研究不同的是，本研究的观察指标中纳入了卵巢大小、盆腔积液阳性患者占比、卵巢内含血体患者占比以及早孕期并发症的情况，结果显示，随着时间推移，卵巢逐渐缩小，盆腔积液逐渐减少及卵巢内含血体比例逐渐降低，有显著性差异(P<0.05)。本研究统计的3例妊娠期出现并发症患者均发生在卵巢体积较大的取卵术后第1个月经周期组。卵巢扭转是妇科临床少见的急腹症之一，正常卵巢发生扭转者较少见。近年来随着ART的发展，促排卵药物刺激卵巢，多个卵泡同时发育，卵巢体积增大，取卵术后滤泡样囊肿变成黄体囊肿，卵巢囊实性改变，密度不均，一旦体位突然改变、肠蠕动、膀胱体积变化或妊娠增大的子宫牵拉均可能导致卵巢扭转发生，发病率升高5倍，增加至0.1%。卵巢扭转一旦发生，若不及时处理，不仅可能导致胎儿丧失，更易影响妇女的生育功能，甚至危及生命。因此，卵巢扭转虽少见，却是IVF-ET的危重并发症之一，常发生于妊娠12周内且多数为新鲜周期移植后妊娠者，鲜有报道冷冻周期移植者发生卵巢扭转。部分全胚冷冻患者因为焦急的心态及经济压力，坚持要求取卵术后尽快行FET，而对于卵巢高反应患者，获卵数多，卵巢大，取卵术后第1个月经周期卵巢远未恢复正常大小，本研究统计显示此时的卵巢径线均值60.05 mm，此时移植，卵巢内存在数个血体，重量进一步增加，且妊娠后HCG持续刺激及盆腔结构改变，相较于正常大小卵巢更易发生扭转。取卵术后第2个及第3个月经周期以上组的卵巢径线均值分别为46.21 mm和33.55 mm，均未统计到相关并发症。因此，卵巢高反应患者，取卵术后恢复1月，即取卵术后第2个月经周期及以后行FET更安全。

根据既往临床经验，一般取卵术后第1个月经周期，由于卵巢尚未恢复，内含多个血体，血清基础FSH及LH水平偏低，多数患者无法正常排卵或卵泡发育周期延长。因此，本研究中取卵术后第1个月经周期组子宫内膜准备方案中HRT比例更高，NC及OI方案占比显著低于另外两组(P<0.05)。2017年Cochrane数据库中的Meta分析[19]提示，尚无足够证据证明哪种内膜准备方案对种植率、临床妊娠率、继续妊娠率及活产率的影响更优，因此本研究在设计时未考虑子宫内膜准备方案对妊娠结局的影响。

近年来，关于母胎远期安全性的研究越来越多。目前多数研究认为相较于新鲜周期移植及自然妊娠，FET能显著降低前置胎盘、胎盘早剥、早产儿、低体重儿等风险，而妊娠期高血压、产后出血、过期产及巨大儿等风险增加[20-23]。关于FET方案与产科并发症相关性的细化分析有了最新的研究发现：2019年Ginström Ernstad等[24]研究认为，HRT方案行子宫内膜准备患者妊娠期及围产期并发症风险高于NC或OI方案，可能与HRT方案中未产生黄体有关。卵母细胞排出后，卵泡逐渐发展为黄体，卵泡内的颗粒细胞和泡膜细胞发展为黄体细胞。黄体不仅产生雌孕激素，而且产生松弛素、血管内皮生长因子(VEGF)及雌激素的血管生成代谢物等参与胎盘形成及母胎界面血管重塑的血管活性因子，这些活性因子还参与母体心血管系统对妊娠的适应与调节[25-26]。因此理论上，若黄体缺失，上述活性因子缺乏则子痫前期、子痫及胎儿发育异常等胎源性疾病的风险增加。2019年Saito等[27]对105 234个FET周期患者资料进行回顾性分析，结果显示：相较于NC方案，HRT方案显著增加妊娠期高血压疾病及胎盘植入等风险；2020年Singh等[28]综述了近年来黄体对FET产科结局影响的相关文献，指出不产生黄体的HRT方案子痫前期、产后出血、巨大儿及过期产等风险增加，认为黄体对预防FET的产科并发症有重要作用。良好的妊娠结局，不仅要实现理想的种植率、临床妊娠率及活产率，更要提高妊娠期及围产期母儿生存质量，提高抱婴质量。FET周期中，似乎产生黄体的NC及OI方案更能达到这一目标。本研究中取卵术后第1个月经周期FET组，由于卵巢未恢复，卵泡发育被抑制，多数患者采用HRT方案，而第2个月经周期FET组，产生黄体的NC及OI方案占比明显上升，且与≥第3个月经周期组相比无明显差别。因此，为降低FET产科并发症，取卵术后第2个月经周期行FET会更加合适。

综上所述，卵巢高反应患者取卵术后不同时间行首次FET，胚胎种植率、临床妊娠率、自然流产率及活产率等常规指标均无显著性差异。但是取卵后第1个月经周期行FET，卵巢内含多个血体或非赘生性囊肿，体积仍较大，远未恢复至正常大小，FET妊娠后卵巢扭转等并发症较易出现；且此周期多数患者无法正常排卵，不产生黄体的HRT子宫内膜准备方案占比更高，缺乏对产科并发症的有重要预防作用活性因子。因此，卵巢高反应患者取卵术后第2个月经周期及以后行FET不仅更安全，而且对改善妊娠期及围产期母儿健康状况可能更有益。当然本研究仍有一定局限性，例如样本量较小、属于回顾性分析、未对产科并发症进行系统分析，因此尚需大样本量的多中心的前瞻性研究对妊娠结局进行全面分析证实这一结论。