超高效液相色谱串联质谱法测定盐酸诺氟沙星原料药有关物质

陈 锐，徐 皓，胡光华

（1.长春市食品药品检验中心化学室，吉林 长春 130000；2.长春市食品药品检验中心抗生素室，吉林 长春 130000）

盐酸诺氟沙星为喹诺酮类药物是一种人工合成的、抗菌谱广泛的高效抗菌药[1]。盐酸诺氟沙星作用于细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ与其形成复合物，抑制细菌DNA的合成与复制而导致细菌死亡。主要用于治疗敏感细菌（葡萄球菌、肺炎球菌、肠球菌）引起的泌尿道、呼吸道及胃肠道感染。为有效控制盐酸诺氟沙星的质量, 对该原料药有关物质测定方法进行研究，对含量大于0.1%的杂质运用HPLCMS联用进行定量分析，并使用质谱对杂质进行定性分析，为盐酸诺氟沙星建立安全有效的质量标准提供研究参考。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器

盐酸诺氟沙星原料药(常州方圆药业有限责任公司，批号：191025) ；诺氟沙星杂质A（中国食品药品检定研究院，批号：130610-201909）；诺氟沙星杂质B（中国食品药品检定研究院，批号：130611-201901） 乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为去离子水。

HP1100高效液相色谱仪（Agilent）；ZMDMicromass电喷雾质谱仪（美国waters）； AB265-S电子天平（德国meuler公司）

1.2 检测条件

HP1100高效液相色谱仪（Agilent），色谱柱：ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相： 0.025mol/L磷酸（用三乙胺调节PH至3.0）-乙腈（84：16），流速为1mL/min，样温为室温，进样方式为自动进样。ZMDMicromass电喷雾质谱仪（美国waters），ESI离子源，正离子扫描， 3.0kV的毛细管电压，电喷雾接口干燥气(N2)流速为540L/h,离子源温度为100℃；锥孔电压为30V，脱溶剂气温为130℃；质量数扫描范围m/z：100～800。

2 方法与结果

2.1 各溶液的制备

精密称取盐酸诺氟沙星原料药10mg，置100ml量瓶中，加适量流动相进行溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 m l，置于2 5 m l量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，作为供试品溶液；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；采用自身对照法，利用诺氟沙星的峰对杂质进行含量计算，其中有A和B的含量大于0.1%。

另精密称取杂质A和杂质B对照品适量，置于200ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取适量， 用流动相定量稀释制成质量浓度分别为20.0μg/ml的杂质A和B混合对照品溶液。

2.2 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液，按稀释倍数为1、1.2、1.5、2、3、6依次逐级稀释，定容，制得6个浓度梯度的系列混合对照品溶液，按照上述质谱条件测定，以峰面积对进样量浓度进行线性回归，绘制标准曲线，求得各成分回归方程、r、线性范围。杂质A的回归方程为Y=1.69X+10566×C，r=0.9998，线性范围为2.934-11.683μg/ml；杂质B的回归方程为Y=1.35X+32451×C，r=0.9999，线性范围为5.623-28.625μg/ml。

2.2 系统适用性实验

取供试液溶液进样，对各组分峰的分离度进行计算，均符合规定。

2.3 专属性考察，

精密称取盐酸诺氟沙星原料药，分别制备酸破坏样品溶液，碱破坏样品溶液，氧化破坏样品溶液，光照破坏样品溶液，高温破坏样品溶液。经破坏后产生的降解产物在上述色谱条件下，与主峰的分离度都较好。

2.4 稳定性试验

取盐酸诺氟沙星原料药，按“2.1”中的方法进行制备，在0、1、2、4、8、12、24 h时分别进样进行测定，记录峰面积。结果：诺氟沙星各时间点峰面积的RSD=0.72%，说明供试液在24h之内的稳定性较好。

2.5 精密度试验

在上述色谱条件下，对“2.1”中配制的供试液连续进样5次，计算杂质A和B峰面积的RSD分别为0.58%和0.67%，说明本实验方法精密度良好。

2.6 检出限考察

用流动相将供试品溶液逐步稀释，并依次进样检测，当信噪比 (S/N) 为3时，杂质A和B的检出限均为0.1ng。

2.7 定量限考察

用流动相将供试品溶液逐步稀释，并依次进样检测，当信噪比 (S/N) 为10时，杂质A和B的定量限分别为0.2578ng和0.2842ng。

2.8 加样回收实验

精密称取已测得杂质A、杂质B含量的盐酸诺氟沙星9份， 每3份分别加入高、中、低3个不同浓度的杂质A和杂质B的混合对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述质谱条件进行测定，杂质A 的平均加样回收率为99.89%，RSD=0.79%；杂质B的平均加样回收率为100.52%，RSD=0.82%。

2.9 样品测定

取5个批次的样品进行检测，按上述方法进行测定，结果均检出杂质A和B，结果见表1。

表1 样品测定结果

2.10 结构解析

对杂质进行质谱检测并提取杂质A和B质谱全扫描图，结果杂质A的母离子m/z为269.66，杂质B的母离子m/z为293.30。对其进行二级质谱扫描，确定其分子式和结构式，结果见表2。

表2 盐酸诺氟沙星杂质A、B的质谱数据

3 讨 论

本研究中选用的诺氟沙星原料药符合企业注册标准。选择0.025mol/L磷酸（用三乙胺调节PH至3.0）-乙腈（84：16）作为流动相可使主成分峰以及各有关物质峰均实现良好的分离，有关物质可被有效检出。根据质谱对含量大于0.1%的杂质A和B进行解析，表明该方法可简便快速并以较高的专属性寻找诺氟沙星原料药中的杂质。同时依据解析过程可推测杂质A可能是在原料药合成过程中引入，杂质B的形成可能是在酸性条件下发生了脱羧反应或在氧化条件下发生了哌嗪环的氧化反应。本研究为盐酸诺氟沙星原料药质量标准的建立以及杂质的检出方面提供了理论依据。