黄精糕减压提取与常压提取降血糖活性成分的比较研究

李俊明 向茗 陈光宇 吴钰 何群 谢梦洲

摘 要：目的：考察减压与常压提取对黄精糕降血糖活性成分的影响，从而优选一种科学、合理、稳定、可行的提取方法。方法：以黄精糕中降血糖活性成分和指标成分总黄酮、总多糖、葡萄糖、鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷与干浸膏得率为评价指标，先用常压回流提取L9（34）正交设计试验法优化醇浓度、加溶剂量、提取时间、提取温度等常压与减压共有的提取工艺参数，再采用最佳工艺参数进行减压提取，95%可信区间重叠法比较减压与常压提取各成分的差异。结果：常压提取最佳工艺参数为：先用醇常压提取1次，加12倍量70%的乙醇，60℃提取1 h，再用水提2次，加水量分别为药材量的12、10倍，水提温度90℃，时间分别为2、1.5 h，减压提取醇浓度、加溶剂量、提取温度、提取时间皆同常压提取，仅提取压力为70%醇提150 hpa，水提70 hpa，减压提取醇提液中总黄酮、鞣花酸含量高于常压提取（P<0.05），减压提取水提液中葡萄糖含量高于常压提取（P<0.05）。结论：减压提取优于常压提取，减压提取最优工艺参数为70%醇提70 hpa，水提150 hpa，先用70%乙醇减压提取1次，加入12倍量70%的乙醇，60℃减压提取1 h，再用水减压提取2次，加水量分别为药材量的12、10倍，水提取温度90℃，时间分别为2、1.5 h。减压提取工艺科学、合理、穩定、可行，可为工业生产提供科学依据。

关键词：黄精糕;减压提取;常压提取;总黄酮;总多糖;鞣花酸;山柰酚-3-O-芸香糖苷

黄精糕由黄精、玉竹、覆盆子、山药、桑葚、枸杞等六味药食同源中药组成，经提取后加辅料制成普通食品，该组方主要降血糖的活性成分为总多糖、总黄酮[1-8]。药理研究表明，鞣花酸[9-10]具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌及增强免疫、降血糖的作用，山柰酚-3-O-芸香糖苷和覆盆子酮皆属于黄酮类成分，具有降血糖功效。原普通食品提取工艺未经优化未将降血糖活性成分充分提取完全，为了最大限度地提取降血糖活性成分，本试验对黄精糕原药材提取工艺进行了优化。因本品降血糖活性成分易氧化分解损失，适合采用减压提取[11]，药材内外形成压力差，有助于药材细胞内活性成分快速向溶液迁移。为探讨黄精糕原药材是否适合减压提取，比较常压、减压两种提取方法的差异，本试验首先优化常压下的最佳提取工艺参数，然后以常压提取的最优参数进行减压提取，与常压提取比较。根据组方中各味药材所含的降血糖活性成分理化性质，全方先醇提1次、醇提药渣再水提2次，以总黄酮、鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、干浸膏得率为评价指标优化醇提工艺参数;以总多糖、鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、干浸膏得率、葡萄糖为评价指标优化水提工艺参数。紫外-可见分光光度法测定各试验样品中总黄酮、总多糖的含量、HPLC法测定鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量，质谱法测定葡萄糖的含量。考察提取方法及工艺参数对降血糖活性成分的影响，为黄精糕原药材提取工业化生产提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

液相色谱柱，月旭科技上海股份有限公司（填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶Ultimate XB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm）;鞣花酸对照品（LOT：SJ0717GE14），上海源叶生物科技有限公司;山柰酚-3-0芸香糖苷对照品（LOT：Y22J11H119335），上海源叶生物科技有限公司;葡萄糖对照品（20161219），上海沃凯生物技术有限公司;芦丁对照品（100080-201811），中国食品药品检定研究院。黄精、玉竹、覆盆子等六味中药，均由湖南省新化县绿源农林科技有限公司提供，经我校王智老师鉴定皆符合2020版《中国药典》一部有关规定。试剂均为分析纯;实验室用水为纯化水。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱系统（包括G1316A四元梯度泵、G1313A标准型自动进样器、G1316A恒温箱、G1314A紫外检测器、Agilent Chemstation 色谱工作站，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）;紫外-可见分光光度计UV900B，北京莱伯泰科;电子天平（ATX124型124 g～0.000 1 g），东京岛津仪器有限公司;10 L旋转蒸发器N-3010，日本东京理化;冷冻干燥机（SCIENTZ-10N），宁波新芝生物科技股份;水分测定仪（SFY-20BL），深圳市冠亚水分仪科技;电热鼓风干燥箱（101-1AB），北京中兴伟业仪器;超高效液相色谱仪（Acquity uplc h-class plus），美国Waters公司;三重四级杆质谱仪（TripleQuad 3500），AB SCIEXDISTRIBUTION公司。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法测定样品中鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量

2.1.1 对照品溶液的制备 （1）鞣花酸对照品溶液的制备：取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL含5 μg的溶液，即得。（2）山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液的制备：取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取各样品干浸膏2 g，精密称定，加入70%的乙醇或纯化水溶解（醇提干浸膏用70%乙醇溶解，水提干浸膏用纯化水溶解），定容至250 mL，然后称重。将每份供试品溶液超声30 min，再次称重，用70%的乙醇或纯化水补足减失的重量。

2.1.3 鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷测定色谱条件

本方法采用液相色谱法（参考2020版《中国药典》第四部通则0512）测定黄精糕中鞣花酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷含量。除另有规定外，按下列方法测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.1%磷酸水溶液为流动相B、柱温30 ℃、流速1.0 mL/min、检测波长为254 nm。按表1中的规定进行梯度洗脱。

（1）空白对照溶液的制备：取甲醇溶液，用0.22 μm有机微孔滤膜滤过，即得，或称为空白对照液。（2）对照品溶液的制备：取鞣花酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含鞣花酸浓度为10.14 μg、山奈酚-3-O-芸香糖苷浓度为193.1 μg的对照品溶液，即得，或称为鞣花酸对照液、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照液。（3）黄精糕供试品溶液的制备：将各黄精糕样品用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得或称为各黄精糕供试液。（4）测定法：精密吸取上述空白对照液、鞣花酸对照液5 μL、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照液5 μL、各黄精糕供试液10 μL注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2.1.4 测定法 鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷：分别精密吸取鞣花酸对照品溶液10 μL，山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液10 μL与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得（图1～图7）。

2.2 超高液相色谱-串联三重四级杆质谱法测定样品中葡萄糖含量方法

本方法采用液相色谱法（参考2020版《中国药典》第四部）测定各样品中葡萄糖含量。除另有规定外，按下列方法测定。

2.2.1 对照品溶液的制备 （1）空白对照溶液的制备：取水溶液，用0.22 μm有机微孔滤膜滤过，即得。（2）对照品溶液的制备：取葡萄糖对照品适量，精密称定，加80%乙腈制成含葡萄糖浓度为10 μg的对照品溶液，即得，或称为葡萄糖对照液。

2.2.2 供试品溶液的制备 按2.1.2项制备水提干浸膏溶液，将各样品溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 色谱、质谱条件 以氨基键合硅胶为填充剂（月旭科技上海股份有限公司，Ultimate XB-NH3型色谱柱，3 μm，2.1mm*150 mm）;以乙腈为流动相A、以水为流动相B、柱温30 ℃、流速0.3 mL/min;按表2中的规定进行梯度洗脱，以三重四极杆串联质谱仪检测;电喷雾离子源（ESI），采集模式为负离子模式;各化合物Q1母离子多重离子扫描，锥孔电压（DP），入口电压（EP）见表3。

1葡萄糖2201792010

2.2.4 测定法 精密吸取上述空白对照液、葡萄糖对照液1、2、5、7、10 μL，注入高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标、进样质量（ηg）为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述各供试液1 μL，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出黄精糕供试液中相当于葡萄糖的浓度，计算，即得。测定结果见图8～11。

2.3 紫外-可见分光光度法测定各试验样品中总黄酮、总多糖的含量

总多糖含量测定：参照2020年《中国药典》第一部黄精多糖测定;总黄酮含量测定：采用铝盐显色法[12]测定样品总黄酮含量。

2.4 常规提取黄精等六味中药降血糖活性成分的基本工艺

各样品分别按处方比例称取黄精、玉竹、覆盆子等6味中药饮片，适当碎段，采用醇提1次，药渣再水提2次的方法。醇提加一定浓度和用量的乙醇浸泡一定时间，不同温度下提取一定时间，过滤。醇提后，药渣再水提2次，加入一定量的水，不同温度下提取一定时间，过滤。醇提滤液与水提滤液分别在50 ℃、30 r/min、30 hPa的条件下减压浓缩后再冷冻干燥成干浸膏备用。

2.5 黄精等六味中药常规提取工艺条件对降血糖活性成分的影响

2.5.1 黄精等六味中药常规提取工艺条件优化的正交设计试验 醇提工艺下，选取对降血糖活性成分影响较大的提取工艺条件即乙醇浓度、加醇量、提取时间、提取温度4个因素进行考察，以总黄酮、鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、干浸膏得率为评价指标，优选出最佳醇提工艺;水提工艺下，先用最佳醇提工艺提取，然后再按水提正交设计水提2次。以2次的加水量，提取时间，提取温度作为条件，以总多糖、鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、干浸膏得率为评价指标，优选出最佳水提工艺。采用L9（34）正交设计试验法考察不同提取条件对各降血糖活性成分的影响，因素水平设计见表4、表5。按2.1、2.2、 2.3项下测定并计算各试验样品中相关成分的含量，结果见表6、表9。因素间方差分析见表7、表10，水平间方差分析见表8、表11。根据统计分析，综合考虑工业生产时间、成本等问题，确定醇提最佳工艺为A3B2C3D1，即乙醇浓度70%、加醇量12倍、提取时间1 h、提取温度60 ℃。

2.5.2 黄精等六味中药醇提工艺的验证试验结果 对黄精、玉竹、覆盆子等6味中药的醇提最优工艺条件进行验证：取3批黄精、玉竹、覆盆子等6味药食同源中药饮片，每批60 g，适当碎断，加70%乙醇，12倍的量，60 ℃水浴，提取1 h，过滤，用旋转蒸发仪在50 ℃、30 r/min、30 hPa的条件下减压浓缩至药材：浓缩液=1.5：1左右，再冷冻干燥成干浸膏粉（含水量<5.0%），测得总黄酮含量为28.20%，RSD=2.76%，鞣花酸含量为0.206 3%，RSD=2.45%，山柰酚-3-O-芸香糖苷含量为0.006 4%，RSD=2.86%，干浸膏得率为38.97%，RSD=1.54%，提取工艺验证结果皆接近或高于正交设计试验中的最高值，表明此工艺条件可最大限度提取出降血糖活性成分，该醇提工艺参数科学、合理、稳定、可行、适用于工业化生产。

根据统计分析，综合工业生产时间、成本等问题，确定水提最佳工艺为A2B3C1，即加水量分别为12、10倍，提取時间分别为2、1.5 h，提取温度90 ℃。

2.5.3 黄精等六味中药水提工艺的验证试验结果 取3批取3批黄精、玉竹、覆盆子等6味药食同源中药饮片，每批60 g，适当碎断，按照最优醇提工艺提取后，过滤，药渣再按照最佳水提工艺提取2次。合并2次水提滤液，在50 ℃、30 r/min、30 hPa的条件下减压浓缩至药材：浓缩液=1.5：1左右，再冷冻干燥成干浸膏（含水量<5.0%），测得总多糖含量为10.01%、RSD=2.52%，鞣花酸含量为0.035%、RSD=2.69%，葡萄糖含量为1.970 5%、RSD=2.47%，干浸膏得率为25.87%、RSD=2.79%，提取工艺验证结果皆略高于正交设计试验中的最高值，表明此工艺条件最大限度提取出降血糖活性成分，该提取工艺参数科学、合理、稳定、可行、适用于工业化生产。

2.6 减压提取与常压提取的比较

分别取2份黄精、玉竹、覆盆子等6味药材，每份60 g，1份在常压下按照最佳醇提工艺提取后過滤，定容;再按照最优水提工艺提取，过滤，定容。另1份药材以相同的工艺参数在旋转蒸发仪中减压提取，醇提时的压力为150 hpa，提取液过滤，定容;水提压力为70 hpa，水提2次提取液合并过滤，定容。正交试验结果表明，醇提液中，鞣花酸的含量远远大于山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量，因此选择鞣花酸为评价指标。水提时，由于水提液中未检测到山柰酚-3-O-芸香糖苷，鞣花酸的含量太低，考察醇提已有该指标，而总多糖的测定误差较大，因此选择葡萄糖含量为评价指标。

由表12可知，减压提取醇提液中总黄酮、鞣花酸含量高于常压提取（P<0.05）;减压提取醇提液中总黄酮含量是常压提取的1.154倍;减压提取醇提液中鞣花酸含量是常压提取的1.208倍;减压提取水提液中葡萄糖含量高于常压提取（P<0.05）;减压提取水提液中葡萄糖含量是常压提取的1.118倍。

3 结论与讨论

中药复方的成分复杂，其效应物质基础是复方所含的成分[13]，单一的考察指标不能筛选出最佳的提取工艺[14]，因此本试验采用多指标成分考察的方法，筛选出最优工艺。本试验建立了同时测定鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量的色谱条件，可用于提取工艺条件研究中平行样品的含量测定，使各样品的测定结果具有可比性。同时本试验建立了超高液相色谱-串联三重四级杆质谱法测定葡萄糖含量方法，方法对比多糖测定具有先进性、科学性、准确性。鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷系易氧化活性成分，减压醇提情况下，液面空气中含氧量降低，可减少这两种成分的损失;葡萄糖系还原糖，所含的醛基易氧化分解，减压水提时可减少该成分的损失。◇

参考文献

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Comparative Study on Decompression Extraction and Atmospheric Pressure Extraction of Hypoglycemic Active Components of Huangjing Cake

LI Jun-ming1，2，3，4，XIANG Ming1，2，3，4，CHEN Guang-yu1，2，3，4，WU Yu1，2，3，4，HE Qun2，XIE Meng-zhou1，2，3，4

（1 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China;

2 Hunan Provincial Medicine & Food Homologous Functional Food Engineering and Technology Research Center，Changsha 410208，China;

3 Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China;

4 The KeyLaboratory of Cardiopulmonary Disease Syndrome Differentiation and Medicinal Diet Therapy in Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of decompression and atmospheric pressure extraction on the hypoglycemic active components of Huangjing cake，and to select a scientific，reasonable，stable and feasible extraction method.Method Precise with yellow cake fall blood sugar in the active ingredient and index components flavonoids，total polysaccharide，glucose，ellagic acid，kaempferol-3-O-rutinosideand dry extract yield as evaluation index，with atmospheric circumfluence extraction L9 （34） orthogonal experimental design method to optimize the extraction process parameters，the optimum processing parameters of atmospheric pressure extraction，the decompression by optimum parameters of atmospheric pressure extraction to extract，95% confidence interval overlapping method comparing the difference between the reduced pressure and atmospheric pressure from the component.Result Atmospheric pressure to extract the best technological parameters for：first use atmospheric pressure extraction time，alcohol and 12 times the amount of 70% ethanol，extract 60 ℃ for 1 h，and then water，secondary water added to 12 times the amount of medicinal herbs，10 times，the water temperature of 90℃，2 h，1.5 h，decompression，amount of solvent extraction and alcohol concentration，extraction temperature，extraction time with normal pressure extraction，extraction pressure of 70% alcohol extraction only 150 hpa，the water 70 hpa，vacuum extracting ethanol-extraction，ellagic acid，total flavonoids content in liquid is higher than normal pressure extraction （P<0.05），vacuum extraction and water extraction liquid of glucose levels higher than normal pressure extraction （P<0.05）.Conclusion The optimal process parameters of decompression extraction were 70% ethanol extraction 70 hPa and water extraction 150 hPa.First，70% ethanol extraction was extracted with decompression once，then 12 times of 70% ethanol was added for decompression extraction at 60℃ for 1 h，and then extracted with water for two times.The amount of water added was 12 times and 10 times of the amount of medicinal materials，and the water extraction temperature was 90℃ for 2 h and 1.5 h.The decompression extraction technology is scientific，reasonable，stable and feasible，which can provide a basis for industrial production.

Keywords：Huangjing cake;decompression extraction;atmospheric pressure extraction;total flavonoids;total polysaccharide;ellagic acid;kaempferol-3-O-rutinoside

基金項目：湖南中医药大学药食同源工程中心开放基金资助（项目编号：2018YSTY06、2018YSTY07）;湖南省重点研发计划项目（项目编号：2022SK2018）。

作者简介：李俊明（1996— ），男，在读硕士研究生，研究方向：中医药膳学。

通信作者：谢梦洲（1964— ），女，教授，博士生导师，研究方向：中医药膳学。