罗伊氏菌素与儿茶素协同对变异链球菌的抑制作用

王思彤，张 彤，金 曼，曲国强，孙雪婷，付恒芳，刘丽波,*，李 春

（1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150028；3.国家乳制品质量监督检验中心理化室，黑龙江 哈尔滨 150028）

变异链球菌在牙齿表面形成生物膜是其致龋的基本特征，牙齿生物膜是自然界中最复杂的生物膜系统之一[1]。变异链球菌通过代谢蔗糖合成胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS），EPS对于凝集黏附菌体细胞于牙齿表面至关重要[2]，高含量的EPS也有利于提高生物膜的稳定性和结构完整性，并为致病菌提供保护，使其免受抗菌剂和其他不良环境攻击的影响[3]。此外，变异链球菌分解糖类物质产有机酸，酸性环境更有利于耐酸菌株变异链球菌发挥生长优势并侵蚀牙齿，进一步促进龋齿形成[4-5]。

茶多酚是绿茶中主要活性物质，而儿茶素类物质占茶多酚总量60%～80%[6]，研究表明其具有抗癌[7]、抗氧化[8]等优良特性。儿茶素类物质能抑制口腔中致龋细菌生长和繁殖[9-10]，且对牙周炎具有良好的预防作用[11]。罗伊氏菌素是由罗伊氏乳杆菌在厌氧条件下发酵甘油产生的[12]，在水溶液中，罗伊氏菌素是一个动态系统，3-羟基丙醛（3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA）最近被确定为该系统的主要抗菌成分[13]。据推测3-HPA可能通过与核糖核苷酸竞争结合位点或与不稳定的巯基反应而抑制细菌DNA合成[14-15]。3-HPA在临床中施用具有促进口腔健康的作用，能够使口腔中变异链球菌的数量明显减少[16]，Krasse等[17]以罗伊氏乳杆菌作为益生菌锭剂，对重度牙龈炎志愿者展开临床实验，结果观察到志愿者炎症减轻明显，牙菌斑面积也大幅度减少。

抗菌药物的应用和机械去除法是防治龋齿的主要传统手段，但长期使用可能使细菌产生耐药性，甚至引起菌群失调。目前，有许多基于天然植物成分[18-19]替代抗真菌药的研究已用于预防龋齿以及促进口腔健康，也有研究发现天然多酚类物质与抗真菌药相结合[20-21]具有协同效应，且能够降低抗真菌药的剂量。本研究为避免化学制剂和抗生素的使用，以及降低单组分的使用剂量和副作用，增强对变异链球菌生物膜的抑制作用，探究儿茶素与罗伊氏菌素的协同效应。为今后开发天然、安全、有益的防龋产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

变异链球菌ATCC25175购于中国微生物菌种保藏中心CGMCC；罗伊氏乳杆菌保藏于东北农业大学教育部乳品科学重点实验室。

儿茶素 卡迈舒（上海）生物科技有限公司（纯度＞98%）；细菌基础培养基（DeMan-Rogosa-Sharpe medium，MRS）、脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

洁净工作台 力康精密科技（上海）有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；紫外分光光度计 上海圣科仪器设备有限公司；扫描电子显微镜 上海复纳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种保存与活化

将变异链球菌由标准菌株置于BHI液体培养基复苏48 h，接着在厌氧培养箱中37 ℃条件下培养18 h，于BHI固体培养基划线分离，镜检确定为纯培养后，用体积分数50%的甘油保存菌株，置于－20 ℃冰箱中保存备用。取－20 ℃冻存的罗伊氏乳杆菌菌液，接种于MRS培养基中，37 ℃活化培养传代使用。

1.3.2 罗伊氏菌素的制备

通过两步发酵法[22]获得罗伊氏菌素用于实验。首先，将罗伊氏乳杆菌在MRS培养基上扩大培养，37 ℃厌氧生长12 h，随后1 500×g离心5 min收获细胞并洗涤制备饥饿细胞，在洗涤过程中使用质量分数0.85% NaCl溶液洗涤2 次以确保没有培养基残留，饥饿时间约为1 h。然后，将洗涤后的细胞重悬浮于含有甘油的缓冲溶液中，37 ℃下培养2 h生产罗伊氏菌素。随后将发酵液10 000 r/min离心5 min，取上清液过滤除菌，－20 ℃保存备用。参照Lüthi-Peng等[23]的方法，测得粗提液3-HPA浓度为145 mmol/L。

1.3.3 最低抑菌浓度及最小杀菌浓度的测定

参照文献[24]的方法并略作修改，在含有质量分数1%蔗糖BHI培养基中制备儿茶素和3-HPA的系列梯度储备溶液。使用96 孔板进行微量测定，分别将100 μL每种浓度的儿茶素和3-HPA加入相应的孔中，接着每孔加入100 μL终浓度为105～106CFU/mL的菌悬液。使儿茶素的终质量浓度分别为8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL，3-HPA的终浓度分别为32、16、8、4、2、1 mmol/L。使用阴性对照（没有加入菌液）和阳性对照（没有任何抑菌物质），在37 ℃下培养微孔板24 h后在酶标仪上测定OD600nm。观察变异链球菌生长浓度无明显变化的最小儿茶素和3-HPA浓度即为最小抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），通过对BHI固体培养基进行平板计数计算并确认最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。一式3 份进行测定，并进行3 次独立实验。

1.3.4 儿茶素和3-HPA对变异链球菌的联合抑菌作用测定

采用棋盘稀释法[25]评估儿茶素和3-HPA对变异链球菌的抑菌作用能力：根据儿茶素和3-HPA对变异链球菌的单独使用时MIC，将2 种药液分别依次对比稀释，稀释浓度分别为2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC。取50 μL儿茶素倍比稀释液，分别加在96 孔板的第2～7列，取50 μL 3-HPA倍比稀释液，分别加在96 孔板的第2～7行。接着每孔再加入100 μL变异链球菌悬液，使菌液终浓度为105～106CFU/mL，以不接种菌液或无抑菌物质的孔作为对照。微孔板37 ℃下培养24 h后测定OD600nm。没有明显生长的最低浓度被认为是MIC。根据单独与联合抑菌情况，按下式计算分级抑制浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI），从而定量评价两者的抗菌作用关系。

FICI＝（儿茶素联合作用时MIC/儿茶素单独作用时MIC）+（3-HPA联合作用时MIC/3-HPA单独时MIC）

当FICI≤0.5时表示协同作用，0.5＜FICI≤1时表示相加作用，1＜FICI≤2时表示无关作用，FICI＞2时表示拮抗作用。实验一式3 份进行测定。

1.3.5 变异链球菌生物膜量的测定

参照Li Bingchun等[26]的方法，略作改动。在96 孔板中加入200 μL含有1%蔗糖的BHI培养基，并接种适宜浓度的变异链球菌菌液，37 ℃培养48 h后。小心地吸出浮游细菌，用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤平板上的生物膜。将200 μL稀释到适宜浓度的儿茶素及3-HPA加入到96 孔中，设置空白对照组。继续温育5、30 min，6、12、24、48 h后，将96 孔板取出，小心地除去培养基，无菌PBS洗涤2 次，每孔添加200 μL体积分数95%甲醇溶液固定微量滴定板中的生物膜，室温下放置20 min。除去甲醇并洗涤，接着向孔中加入0.1%结晶紫125 μL在室温下温育15 min。无菌PBS洗涤3 次，37 ℃干燥2 h后，每孔加200 μL 95%乙醇溶液，振荡脱色15 min，以充分释放结晶紫，手动混合孔中的内容物，最后每孔75 μL转移到新的96 孔板中，并用分光光度计测定OD600nm。

1.3.6 EPS含量的测定

参照Goc等[27]方法，略作如下改动：向24 孔板中加入3 mL含有质量分数1%蔗糖的BHI培养基，接种2%菌液，37 ℃下培养48 h以形成变异链球菌生物膜，除去浮游细菌，用无菌PBS洗涤生物膜2 次。接着用儿茶素及3-HPA处理生物膜5、30 min，6、12、24、48 h后吸出培养液，用细胞刮刀将生物膜刮下转移到1.5 mL离心管中，用1 mL蒸馏水将生物膜重悬，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，收集上清液，重新悬浮生物膜沉淀，洗涤2 次，再次以6 000 r/min离心10 min，合并上清液，检测水溶性多糖（water-soluble glucan，WSG）含量。水洗后的沉淀加1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液洗涤，离心3 次，合并上清液，测定水不溶性多糖（water-insoluble glucan，WIG）含量。两部分上清液各取l mL，分别加入3 mL无水乙醇，4 ℃冰箱放置过夜，离心，弃水相，沉淀分别加入1 mL蒸馏水、1 mL 0.l mol/L NaOH溶液溶解，用蒽酮法分别测定水溶性及水不溶性葡聚糖含量。

蒽酮法：取样品1.0 mL，加蒽酮试剂3 mL，95 ℃水浴煮沸6 min，冷却，测其625 nm波长处的吸光度，根据标准曲线及稀释倍数计算样品中多糖的含量。

1.3.7 产酸能力的测定

参考邵旭媛等[28]方法并略作改动。将儿茶素及3-HPA溶解于初始pH值为7.4的BHI培养基中。实验组菌液与药液按1∶10（V/V）接种变异链球菌，在37 ℃条件下分别温育5、30 min以及6、12、24、48 h后，培养物经6 000 r/min离心5 min，取上清液，测定上清液的pH值，并计算培养前后pH值的变化值（ΔpH）。

1.3.8 扫描电子显微镜观察生物膜结构

使用扫描电子显微镜观察变异链球菌生物膜结构的改变[29]，在6 孔板中置入细胞爬片，每孔中分别加入3 mL单一儿茶素、3-HPA和协同浓度组并接入细菌培养液，对照组只接入菌液。37 ℃培养24 h，接着用戊二醛在4 ℃固定细胞2 h，PBS冲洗2 次，再分别用梯度体积分数（50%、70%、90%、100%）乙醇脱水，最后将样品冷冻干燥，喷金镀膜，扫描电子显微镜观察。

1.4 数据统计分析

采用Origin 2018软件作图，运用SPSS Statistics 20软件对数据进行处理分析，组间差异显著性采用单因素方差分析进行比较（P＜0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 儿茶素和3-HPA的MIC及MBC

经测定，儿茶素和3-HPA对变异链球菌的MIC分别为1 mg/mL及8 mmol/L，MBC分别为2 mg/mL及10 mmol/L。

2.2 儿茶素和3-HPA对变异链球菌的协同作用

如表1所示，儿茶素对变异链球菌单独用时MIC为1 mg/mL，3-HPA单独使用时MIC为8 mmol/L。计算各标记（－）的联合使用的FICI，选取最优联用组合。表中标记（－）*处显示儿茶素的MIC为0.125 mg/mL，3-HPA的MIC为2 mmol/L。两抑菌物质联用时MIC明显低于单独使用时MIC，将得到的MIC代入FICI公式，计算并进行判断：FICI＝0.125/1+2/8＝0.375＜0.5，表明儿茶素和3-HPA具有协同作用，因此采用（－）*处质量浓度组合进行后续实验。

表1 儿茶素和3-HPA对变异链球菌联合药敏实验结果Table 1 Inhibitory effect of catechin combined with 3-HPA against S.mutans

2.3 变异链球菌生物膜量的测定结果

蔗糖可影响龋齿的生物膜特性，培养基中添加1%～5%的蔗糖可提高变异链球菌生物膜积累量和生物膜结构的稳定性，由此可能增加其致龋的风险[30]。本实验采用质量分数1%蔗糖的BHI培养基来进行生物膜测定实验。在变异链球菌成熟生物膜上测试了3 组抑菌物质的抑菌作用效果。图1为单一儿茶素（MIC）或3-HPA（MIC）以及它们协同使用（儿茶素（1/8 MIC）+3-HPA（1/4 MIC））时对不同处理时间变异链球菌生物膜生成量的影响。6 h时仅3-HPA单独作用和协同作用显示出对目标菌株的抑制作用。在培养12、24 h及48 h时儿茶素或3-HPA单独及联合使用都显示出对变异链球菌生物膜显著的抑制作用，仅用MIC儿茶素处理时生物膜量降低了19%、23.8%和21.4%，而协同组合降低了27.4%、33.5%和34.3%生物膜的量（P＜0.05），这与Gabe等[31]研究没食子酸辛酯对变形链球菌生物膜形成结果相似。而短时间10 min及30 min处理未见有显著抑制作用（P＞0.05）。

图1 儿茶素和3-HPA单用及其联合使用对变异链球菌生物膜的影响Fig.1 Effect of catechin and/or 3-HPA on S. mutans biofilm

2.4 EPS含量的测定结果

图2 儿茶素和3-HPA单用及其联合使用对变异链球菌WSG（A）和WIG（B）的影响Fig.2 Effect of catechin and/or 3-HPA on contents of water-soluble glucan (A) and water-insoluble glucan (B) in S.mutans

变异链球菌利用蔗糖分泌两种EPS，WSG被释放到培养上清液中为细菌提供能量，WIG黏附在牙齿表面并参与菌斑基质的形成，EPS含量是衡量变异链球菌致龋性能的重要指标[32]。如图2A所示，WSG在6～12 h时分泌能力最强，其含量显著增加，这与早期生物膜形成需要大量的能源物质与代谢底物有关[33]，之后在12～48 h时分泌量以基本稳定的趋势不断提高。用3 组抑菌物质处理变异链球菌6 h后开始起到明显的抑制作用，在处理24 h和48 h后，与对照组相比，协同组WSG分泌量分别显著降低50.3%、45.2%，而单一儿茶素组WSG分泌量分别降低了27.8%、27.3%（P＜0.05）。短时处理10 min后，单一药物处理组及协同组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

如图2B所示，对照组WIG在30 min～12 h时分泌量明显增加，这与此阶段需要大量WIG来维持生物膜结构的形成有关[34]，之后12～48 h WIG合成能力有所下降，分泌量增加趋势趋于和缓平稳。因此，抑菌物质主要在30 min～12 h时施用抑制作用最为明显，这与黄晓晶等[35]发现的在不同时间段变异链球菌体外EPS合成能力不同的结论相似。3 组抑菌物质的WIG分泌量在30 min～48 h时与对照组相比差异显著（P＜0.05），且在24～48 h时协同组WIG分泌量显著低于两个单一用药组（P＜0.05），这一结果与2.3节3 组抑菌物质对变异链球菌生物膜量的抑制结果相似。而在短时处理10 min后各抑菌用药组与对照组相比未见有统计学上差异（P＞0.05），这可能由于作用时间较短，单一儿茶素（MIC）或3-HPA（MIC）及协同组未对变异链球菌起到有效抑制作用。

2.5 产酸能力的测定结果

3 组抑菌物质处理不同时间后对变异链球菌产酸能力的影响如图3所示，在6～48 h时3 组抑菌物质之间酸度变化均有显著差异（P＜0.05），按照抑制产酸能力由大到小的顺序排列为：协同组（儿茶素（1/8 MIC）+3-HPA（1/4 MIC））＞3-HPA（MIC）＞儿茶素（MIC）。0～6 h与0～12 h时协同组对上清液中酸度影响最为明显，6、12 h时，协同组作用后pH值分别降低0.53±0.02、0.81±0.08，与对照组相比，协同组分别抑制了76%、73%有机酸的产生。这可能也与此阶段抑制了WSG的分泌，从而减少了产酸途径中代谢底物量有关。在处理30 min时，仅单一儿茶素（MIC）组与空白对照组之间ΔpH值无显著性差异（P＞0.05），短时间处理10 min各组之间ΔpH值均无统计学上意义（P＞0.05），处理6～48 h时各抑制物质组与对照组相比均有显著差异（P＜0.05）。

图3 儿茶素和3-HPA单用及其联合使用对变异链球菌产酸能力的影响Fig.3 Effect of catechin and/or 3-HPA on acid-producing capacity of S.mutans

2.6 生物膜结构的扫描电子显微镜观察结果

图4 为对照组和经3 组抑菌物质处理后变异链球菌的扫描电子显微镜图，未经任何处理的变异链球菌菌体表面光滑呈短杆状（图4A1、B1），各个细体紧密相连，层层叠加，由密集的生物膜基质紧紧包裹围绕，形成密集均匀的网状结构，也因此其生物膜具有一定的厚度。而图中致密生物膜基质的形成是由于菌株培养基中添加了1%的蔗糖，蔗糖被变异链球菌利用生成更多葡聚糖，增强菌体黏附力的同时增加生物膜胞外基质的量[36]。观察经过3 组抑菌物质处理的电子显微镜图，可发现变异链球菌菌体表面粗糙，有褶皱存在；菌体细胞数量明显减少，菌落之间连接较为松散，生物膜结构出现明显改变，生物膜胞外基质粗糙稀疏，网状结构孔隙变大，出现不规则管道结构，生物膜厚度降低明显（图4）。

图4 儿茶素和3-HPA单用及其联合使用时的变异链球菌扫描电子显微镜图像Fig.4 Scanning electron microscopic image of S. mutans treated and not treated with catechin and/or 3-HPA

3 讨 论

本实验通过二步发酵法，利用罗伊氏乳杆菌转化甘油生产3-HPA粗提液。采用棋盘稀释法分析得到当儿茶素（1/8 MIC）和3-HPA（1/4 MIC）联合使用时其具有协同作用，因此采用此时的协同浓度组合与单一儿茶素（MIC）和3-HPA（MIC）相对比进行抑菌机理的探讨。结果表明协同组抑菌效果优于单一用药组，协同处理能显著减少变异链球菌生物膜的生成、降低膜外基质EPS的分泌、抑制产有机酸的能力，可看出其能够有效抑制菌体在齿面的聚集与黏附，并参与底物代谢提高酸度，维持有益菌生存的口腔环境。3 组抑菌物质处理组的扫描电子显微镜图也可看出菌体数量减少，生物膜结构改变，膜厚度降低，进一步验证了儿茶素及3-HPA对变异链球菌的抑菌机理。Wasfi等[37]对乳酸杆菌发酵上清液抑制变异链球菌作用机理均得到类似结论。Yang Ning等[21]将表没食子儿茶素没食子酸酯与抗真菌药协同作用口腔念珠菌，观察发现处理组能够显著降低生物膜的生成量，且协同使用增强了抑菌效果，降低了抑菌药物的剂量，本实验得出的结论与其研究相似。本研究为安全、新型的抑龋产品的开发提供了理论依据。但值得注意的是，在实际应用于龋齿治疗中，还应当考虑适宜的作用时间，形成便捷有效的预防措施。