外源酶对改善茶叶品质作用的研究进展

薄佳慧，张杨玲，宫连瑾，杜哲儒，肖力争

（湖南农业大学园艺学院，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，茶学教育部重点实验室，植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128）

酶工程技术与茶叶生产相结合最早可追溯到上世纪70年代[1]，现阶段，该技术已经成为茶叶加工领域提高茶叶品质的主要外援技术之一。有研究人员将茶叶加工中采用的外源酶定义为在茶叶生产过程中，通过人为施加的多种来源酶类，包括从茶鲜叶、茶幼果、其它植物或其愈伤组织以及微生物培养基中提取获得的酶[2-4]，但茶鲜叶、茶幼果中提取的生物酶是否属于茶叶加工中的外源酶还有待进一步探讨。如今，随着生物技术应用的飞速发展，酶技术有了革命性的变化，利用酶促反应原理将外源酶与茶叶生产相结合对提高各类茶叶的品质均有重要作用。生产加工是继鲜叶采摘后决定茶叶品质的第一步，在茶叶加工过程中外源酶的应用主要表现为利用酶高效的生物催化能力，促进茶叶中不利、低效或无效成分的有利转化，改善成品茶的色、香、味等风味特征及营养价值。通过综述外源酶技术在茶叶初加工中的研究及其应用，为茶叶加工中的酶法应用提供一定的理论借鉴，进一步促进茶产业可持续发展，满足消费者对茶产品日益丰富的消费需求。

1 应用于茶叶加工中的外源酶

在茶叶加工中应用较多的外源酶类主要包括外源单宁酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，这些外源酶可促进茶叶细胞壁的溶解，同时被破坏的细胞壁总体结构会进一步发生酶促和氧化反应，在一定程度上提高或降低影响茶叶品质的某些成分含量。

1.1 主要外源酶及其作用机理

单宁酶，属水解酶，外源单宁酶主要来自于曲霉，且制备技术已经相当成熟[5-6]。从植物材料中释放的外源水解酶具有裂解作用，能够有效裂解植物中化学物质和细胞纤维素骨架之间的化学键[7]，专一性断裂茶叶内没食子单宁中的酯键和缩酚酸键。外源单宁酶可有效促进沉淀的复溶和回收利用，进而提高茶汤的澄清度、透明度和色泽[8-10]。单宁酶是茶叶加工中运用最多的外源酶类，被广泛应用于绿茶、红茶、乌龙茶、黑茶等茶类中。

纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系，亦属水解酶，其来源主要为微生物真菌和曲霉，同时利用茶渣也可以产生纤维素酶[11]。应用于茶叶生产中能够提高可溶性糖和水浸出物的含量及芳香性物质的释放[12-13]。

果胶酶主要作用于在制茶叶细胞壁中的果胶类物质，促使细胞结构的破坏与解离，同时，果胶酶对茶汤澄清度的改善有显著作用，果胶酶与纤维素酶组成复合酶应用于茶叶生产实际中效果更佳。

蛋白酶是能水解蛋白质肽键的专一酶类，微生物、细菌、真菌是蛋白酶的主要来源[14]。蛋白酶可提高茶叶中氨基酸含量，有助于滋味物质和香气物质的产生，并能显著提高茶汤透光率，使茶汤更澄澈[15]。其中，碱性蛋白酶对茶叶籽和茶渣所含蛋白的酶解作用较强，且酶解产物清除DPPH自由基能力较好[16-17]。

多酚氧化酶是一类含铜质体的氧化还原酶，能催化多酚类物质发生氧化反应[18]，广义上的多酚氧化酶包括酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶和漆酶。多酚氧化酶能够催化儿茶素氧化形成茶黄素和茶褐素，漆酶可以通过与聚合物的自偶联或交叉偶联来转化酚类物质，从而改善茶叶品质。

1.2 其它外源酶

以上5种外源酶均能对茶汤的澄清度、香气以及内含物质产生重要影响，除上述5种应用较为广泛的外源酶类，淀粉酶在茶叶加工中的应用亦较多。淀粉酶具有良好的活性、底物特异性、热稳定性、较宽的pH值等特性，且对变性剂和重金属有良好的抗性[19]。除此之外，利用α-淀粉酶的活性抑制率，优化茉莉花茶的拼配工艺，可制得具备降血糖功效显著且感官品质优异的茉莉花茶拼配茶[20]。通过在黑毛茶渥堆过程中添加淀粉酶研究发现，茶汤中茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖和水浸出物的含量均明显增加[21]。此外，木瓜蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、α-半乳糖苷酶以及其它植物酶等外源酶类可以单独或组成复合酶，不同程度地应用在各类茶叶加工过程中[22-24]。

2 外源酶在提升茶叶品质中的应用

茶叶品质的形成与人工所创造的外部条件有一定关系，如利用或控制外源酶，使茶叶发生一系列理化变化从而加速或更稳定地形成某类茶特有品质[25]。目前，外源酶技术主要集中于提高夏秋茶风味品质及茶资源高效利用率两个方面。由于夏秋茶中茶多酚、咖啡碱含量所占比例较高，游离氨基酸含量较低，因此所制成品茶苦涩味重[26]，致使大部分茶区对夏秋茶利用程度偏低。采用添加外源酶制剂的方法，选择合适的酶类运用于茶叶加工中可以有效降低茶多酚、儿茶素等具有苦涩味的成分，提高可溶性糖、茶氨酸、非没食子酸等非苦涩味成分，改善茶叶口感和接受度。

2.1 外源酶于绿茶加工中的应用

绿茶富含儿茶素等多酚类成分，具有丰富的药理活性，抗菌作用显著[27]。由于秋茶儿茶素含量较高且茶叶中含有没食子儿茶素（gallocatechin，GC），由秋季茶鲜叶加工而成的绿茶比由春叶加工而成的绿茶更苦、更涩。绿茶加工中外源酶的应用常见于揉捻阶段，在秋季绿茶揉捻阶段加入500 U/g单宁酶（单宁酶提前溶于100 mL 5℃的水），可将GC水解为非没食子儿茶素和没食子酸（galllic acid，GA），随着外源单宁酶用量的增加，绿茶浸出物的苦味和涩味强度降低，而甜味和接受度整体提高，明显改善了秋季绿茶产品的口感[28-29]；于夏季绿茶揉捻工序中添加外源单宁酶，同样可使夏茶的苦涩味降低，鲜醇度增高,木瓜蛋白酶和纤维素酶则能明显提高茶汤中氨基酸与可溶性糖的含量,并与添加的外源酶浓度呈显著正相关[30-31]。

2.2 外源酶于白茶加工中的应用

有研究报道，影响白茶茶汤浸提液中茶多酚浸出量的顺序依次为浸提温度、时间、酶添加量[32]。以夏季福鼎大毫茶为原料，在萎凋叶失重率达到30%时喷洒液叶比（外源酶液与在加工茶叶的质量比）为1∶10的1.0%果胶酶对白茶品质的提升效果显著，此外纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶3种外源酶处理均能显著提高茶汤中的水浸出物、可溶性糖、氨基酸含量，大幅改善茶汤品质，与未添加外源酶的白茶差异达到显著或极显著差异[33]。张艳梅等[23]在采用紫鹃品种制作白茶的萎凋过程中，利用外源脂肪酶并融合轻微包揉和轻微发酵的新工艺，发现该紫鹃白茶在香气、滋味等各方面都优于对照组，茶氨酸、茶多酚、可溶性糖和花青素含量明显提升。

2.3 外源酶于黄茶加工中的应用

研究发现，在黄茶杀青或揉捻工序中添加来自茶鲜叶中获取的粗酶液（内含茶多酚、儿茶素、游离氨基酸、可溶性糖），“酶促黄变”效果明显，显著降低了黄茶内茶多酚含量和叶绿素含量，提高了可溶性糖、茶黄素和茶红素含量，在保留传统黄茶品质特征的基础上，进一步改善了黄茶的总体品质，但此粗酶液要保证现制现用，充分保证酶活力[34]。

2.4 外源酶于青茶加工中的应用

夏季乌龙茶可溶性糖含量较少，茶多酚和咖啡碱含量较高，苦涩味明显，香气较差，在提高产量的前提下改善夏茶整体品质尤为重要。有研究在10 kg安溪铁观音夏茶干燥过程中，喷洒220 mL浓度为0.075 g/L的漆酶和0.2 g/L的α-半乳糖苷酶水溶液，充分干燥后茶叶中儿茶素和总多酚含量分别降低了11.9%和13.3%，可溶性糖和水浸出物含量分别提高了19.4%和6.6%，挥发性成分显著增加，成茶的滋味和香气明显改善[24]；在揉捻阶段加入外源β-葡萄糖苷酶能促使乌龙茶芳樟醇及其氧化物和相似结构物质的大量释放，提高乌龙茶干茶香气和滋味[35]；摇青后使用β-葡萄糖苷酶和漆酶处理能显著提高铁观音香气成分含量，在初烘前添加漆酶和α-半乳糖苷酶能改善夏茶的香气和滋味品质，二者复合使用时，制得的夏茶品质类似早秋茶[36]。

铁观音品质的不稳定性是导致其近几年市场占有率大幅缩小的原因之一，利用固态发酵获得的单宁酶对劣质铁观音进行二次加工，可催化水解表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC），并能提高水解产物的抗氧化活性与耐低温储藏性[37]。黑曲霉发酵可以产生多种胞外蛋白酶组分,是常用的食品酶制剂生产菌株。李红[38]利用察氏、果胶、柚皮、麦麸以及茶叶梗等培养基所得黑曲霉酶液制备胞外酶，用该胞外酶处理后的乌龙茶茶汤香气物质含量明显提高，其中茶梗培养基所得酶液可使茶汤苦涩味明显降低，但酸味明显。可以得出以下结论，外源酶可运用于乌龙茶加工的多个阶段，其中以漆酶与半乳糖苷酶的酶学特性较为一致，相互影响小，适合作为复合酶使用且效果较为突出，但过量的漆酶会使得茶汤滋味平淡，过高浓度的半乳糖苷酶会导致香气不持久等问题。

2.5 外源酶于红茶加工中的应用

红茶以红浓明亮的茶汤、甜香和甜醇的滋味为品质特征，发酵是红茶加工的关键工艺，以促进多酚氧化酶的充分氧化为目的。在红茶发酵过程中添加来自茶叶真菌制备纯化后的纤维素酶、漆酶、果胶酶和木聚糖酶，纤维素酶和漆酶的体积比为3∶2时红茶品质明显优于传统发酵工艺红茶[39]。茉莉酸甲酯被广泛应用于提高食品质量，用外源茉莉酸甲酯喷洒龙井43号茶树上的鲜叶，后采摘制成红茶，红茶内的多酚氧化酶和β-原氧化酶的基因表达水平分别上调了2倍和3倍，萜烯醇和己烯酯的含量显著增加，同时诱导产生了诸如胡椒烯、山苍子醇和吲哚等新的挥发性成分，香气质量明显高于未处理的红茶[40]。利用纤维素酶和木瓜蛋白酶组成复合酶处理萎凋阶段的英红九号，能极大提高英红九号可溶性糖的含量和茶多酚的含量[41]。研究发现，砂梨多酚氧化酶、外源纤维素酶、木聚糖酶及木瓜蛋白酶处理均可提高红茶茶汤可溶性糖含量，促进红茶发酵和茶红素、茶黄素的生成，从而改善茶汤的色泽和香气[42-43]。外源酶的应用可充分提高茶汤的甜度和香气的持久度，对红茶品质的提升具有极其显著的积极作用。

2.6 外源酶于黑茶加工中的应用

黑茶属于后发酵茶，在其渥堆发酵过程中，真菌对初制黑茶性状的形成有很大的贡献，真菌外源酶在黑茶初制过程中也可起到重要作用，在渥堆期间黑毛茶中的微生物群落除了不能产生过氧化物酶活性外，多酚氧化酶、纤维素酶和果胶酶的活性均有不同程度增加[44]。外源酶技术在黑茶加工中的应用研究颇丰，针对云南普洱茶、广西六堡茶、四川砖茶等的各阶段工艺均有研究。

酶活性与普洱茶生产过程中的成分变化与其质量密切相关，联合利用纤维素酶、果胶酶、多酚氧化酶、多糖水解酶类、单宁酶、蛋白酶等制成复合酶制剂对云南大叶种晒青毛茶进行液态发酵，可显著缩短发酵周期，促进发酵叶营养物质的形成，大幅度降低多酚含量，提高茶黄素、总碳水化合物、多糖、氨基酸和蛋白质含量，促进内含物质氧化[45-46]。随着研究的深入，发现添加不同浓度外源酶均可显著调节普洱生茶浸提液内含成分的比例，当漆酶与蛋白酶、单宁酶3种酶以一定比例对该浸提液进行处理时，可溶性糖、氨基酸及茶褐素含量分别是未处理前的3.49倍、1.10倍、4.32倍，其中，漆酶对茶褐素氧化贡献最大，该研究为实现普洱茶走向酶法快速提高茶品质的液态化产业道路奠定了一定基础[47-48]。在六堡茶渥堆过程中添加外源纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶及过氧化物酶可以明显提高其水浸出率，且有利于色素转化，缩短渥堆的时间从而改善茶叶的品质[49-50]。另外，有研究通过向四川黑毛茶加入土豆外源酶，并结合湿热处理，发现显著增加了β-芳樟醇、α-雪松醇等花果香型物质，明显降低了陈味和霉味，改善了四川黑毛茶的总体品质[51]。

3 结论和展望

外源酶制剂在茶叶初加工中的应用主要集中在提高茶叶风味、改善口感、促进结构衍生以增加或减少某些内含成分等方面。目前，我国各大茶产区普遍存在夏秋茶及中低档茶资源利用率偏低的问题，基于六大茶类的品质特征、制作工艺及品质提升的重要性，研究人员将六大茶类加工工艺与外源酶技术相结合，成功实现了快速、高效生产风味俱佳的茶叶。同时从粗老叶、茶梗等茶废弃物中可提取一定的酶继续作用于茶叶加工过程，既环保节约又有效提高茶资源利用率。

然而，酶技术的推广应用将是对传统制茶工艺的一种挑战，当前外源酶作用于茶叶所发生的系列反应机理还尚不清晰，这也是引起人们对外源酶与茶叶生产相结合是否安全的顾虑源头。当前有关改进茶叶品质的外源酶种类方面的研究依旧不足，如何根据不同条件选择适合的酶来源、种类和配比是今后外源酶应用在各大茶类加工中需要解决的主要问题之一，同时酶的保存期限、稳定性、封装材料以及不同茶类添加外源酶的最佳工艺参数的探索仍有待进一步探索。因此，未来可结合蛋白组学分析多酶组学活性，为实现外源酶技术在茶叶生产加工中发挥安全稳定高效的作用。