采用GC-O-MS结合香气活力值分析兰陵美酒香气活性组分特征

樊杉杉，管桂坤，苏雅芝，万自然，刘明坤，王涛，郭一民，徐岩， 范文来*，陈双*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122) 2(江南大学 酿造微生物与应用酶学实验室，江苏 无锡,214122) 3(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡,214122) 4(山东兰陵美酒股份有限公司，山东 临沂,276000)

兰陵美酒是我国历史传统名酒之一，酿制历史可追溯到殷商时代，距今已有3000多年历史。兰陵美酒以北方黍米为原料，采用双边发酵的传统方法，在麦曲和酵母的作用下进行前酵，之后将其注入瓷缸进行后酵，以完善风味使其绵柔醇厚，物质平衡，半年后启缸[1]。其酒体呈琥珀光泽，晶莹明澈，保有原料和发酵产生的天然混合香气，浓郁袭人，具有怡人的风味。

黄酒独特的口感和香气决定了感官评价与风味鉴定结果，是衡量黄酒质量的重要因素之一，也是带领和吸引消费者的重要因素之一。目前已有研究对不同的黄酒香气组分进行解析，王丽华等[2]利用气相色谱-闻香(gas chromatography-olfactometry, GC-O)方法分析得到了黄酒中比较重要的11种化合物。江伟等[3]对黄酒中34种重要香气物质进行了定量分析，并比较了这些物质在不同年份黄酒中的差异和变化规律。罗涛等[4]利用顶空固相微萃取技术(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrum, GC-MS)对黄酒样品进行分析，并对其中的54种物质进行了定量分析[4]。CHEN等[5-7]利用分子感官科学对江浙地区的古越龙山黄酒特征香气进行了解析，随后利用香气萃取稀释分析(aroma extract dilution analysis, AEDA)结合香气活力值(odor activity value, OAV)比较了传统型和现代型黄酒的风味差异，之后又对新酿和陈酿古越龙山黄酒的香气成分进行了比较，研究表明葫芦巴内酯、香兰素、3-甲基丁醛和苯甲醛对陈年黄酒的整体香气起关键作用。

黄酒一般是以粮食谷物等为酿造原料，经过多种微生物发酵而成的低酒精度饮品[8]。黄酒香气成分复杂，而且各地区酿制黄酒时所采用的原料、酵母、水源和采用的技术也不尽相同，因此给予了黄酒不一样的风味特征。目前，尚未见对以黍米为酿造原料的北方兰陵美酒中香气活性组分的研究报道，其风味化学特征还缺乏系统的研究，对风味特征的主要化学物质还不明晰。而兰陵美酒的风味特征不仅决定着其风味与品质，对其生产工艺、微生物体系等起着重要的反向调控作用，因此有必要对兰陵美酒的风味特征进行研究。

本课题以兰陵美酒为研究对象，采用感官分析对兰陵美酒进行感官评价得到其风味轮廓图；通过HS-SPME和液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)对风味物质进行萃取分离，采用GC-O-MS确定香气组分；采用HS-SPME和液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)结合GC-MS的全定量方法，对兰陵美酒进行定量分析及OAV值计算，解析香气活性组分。本文研究对了解兰陵美酒香气成分的形成机理，实现风味导向兰陵美酒酿造技术的开发，稳定产品品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要仪器

GC 6890N-MSD 5975气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司；ODP 2闻香仪、多功能自动进样器，德国Gerstel公司；DC-12氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司；Millipore-Q超纯水系统，美国密理博公司。

1.1.2 主要试剂

色谱纯： CH2Cl2，百灵威科技有限公司；无水乙醇，上海安谱科学仪器公司，C5～C30正构烷烃标准品、化合物定性及定量时所用标准品，Sigma-Aldrich 公司；

分析纯： Na2SO4、 NaCl、2 mol/L H2SO4溶液、0.1 mol/L NaOH标准溶液，上海国药集团。实验用水均为煮沸 5 min 后冷却至室温的超纯水。

1.1.3 实验材料

兰陵美酒样品，山东兰陵美酒股份有限公司，乙醇体积分数为12%，属于半甜型黄酒。

1.2 实验方法

1.2.1 兰陵美酒香气轮廓图的构建

参照文献的方法[9]，挑选12位品评员进行为期3个月共3轮的感官训练。在第1轮的训练中，品评员需要对将近30种不同气味标准品进行闻香并熟悉其香气特征；第2轮训练中，品评员以黄酒风味为基础对兰陵美酒样品多次嗅闻并进行香气描述词的收集，最终经过讨论筛选出7个重要的香气描述词；第3轮的训练中，针对这7个香气描述词配制不同浓度的参比样进行香气强度训练，对品评员的香气强度打分进行矫正。最后，这些品评员对从兰陵黄酒中筛选出的7个主要香气描述词进行打分(10分制，0表示没有闻到该香气，1～3强度较弱，4～6中等，7～10较强)。最终结果取所有品评员结果的平均值，并绘制兰陵美酒香气轮廓图。

1.2.2 兰陵美酒香气组分解析

兰陵美酒样品中香气组分的解析参照陈双等[10]报道的方法进行了部分调整。具体分析过程如下：

HS-SPME提取挥发性组分：称取1.5 g NaCl，量取5 mL样品于顶空瓶中，用带PTFE/蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密封。使用多功能自动进样系统进行HS-SPME。萃取过程如下：采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头，萃取温度50 ℃，样品平衡时间5 min，萃取时间50 min，乳化器转速500 r/min。萃取结束后将萃取头置于GC进样口在250 ℃下解吸附5 min，进行GC-MS检测分析。

LLE提取挥发性组分：取250 mL酒样加入NaCl至饱和，用CH2Cl2在分液漏斗中萃取3次(每次50 mL)，合并有机相记为萃取相Ⅰ。加150 mL超纯水到萃取相Ⅰ中，再用配制好的0.1 mol/L NaOH溶液调节pH至9，用分液漏斗分层，上层水相记为萃取相Ⅱ,有机相记为萃取相Ⅲ(中碱性组分记为NBF)，随后用2 mol/L的H2SO4溶液调节萃取相Ⅱ的pH为2，用CH2Cl2在分液漏斗中萃取3次(每次25 mL)，合并有机相得到萃取组分Ⅵ(酸性组分记为AF)。NBF、AF均加入适量的无水Na2SO4(呈流沙状即可)置于-20 ℃下干燥过夜。氮吹浓缩至500 μL。

GC-O-MS解析挥发性香气组分：气相色谱-质谱仪串联闻香装置用于GC-O-MS分析。

GC条件：进样口与检测器温度均为250 ℃，载气为高纯He，流速为1 mL/min，进样模式为不分流进样，色谱柱采用DB-FFAP (60 m×0.32 mm,0.25 μm)。升温程序：起始温度50 ℃，保持2 min后，以6 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持15 min。

MS条件：以EI电离源为离子源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围35.00～350.00 amu。

GC-O方法：挑选2名经过训练，熟悉各种香气描述的闻香员，分别对经过HS-SPME的酒样和LLE后的中碱性组分(NBF)和酸性组分(AF)进行时间-强度法的闻香，每个样品嗅闻2次。每个香气物质的香气强度为2人嗅闻12次的平均值。

1.2.3 兰陵美酒香气活性组分解析

HS-SPME-GC-MS定量香气组分：针对大部分香气强度高于2.0的香气组分利用HS-SPME-GC-MS进行定量分析。吸取一定量的各香气组分标准品，加入到体积分数10% 的乙醇中制成混合标准母液，并进行梯度稀释(以2为梯度稀释倍数)，一共10个点，且各类标准品分开配制。在每个梯度的标准样品和酒样中分别加入40 μL的叔戊酸内标(1197.10 μg/L)和其他混合内标[2-辛醇(294.08 μg/L)、L-薄荷醇(680 μg/L)、乙酸-2-苯乙酯-D3(146.34 μg/L)、辛酸乙酯-D15(70.83 μg/L)、正己醇-D13(322.66 μg/L)、2-甲氧基-苯酚-D3(307.37 μg/L)和乙酸-L-薄荷酯(12.17 μg/L)]。在与1.2.2小节的相同条件下进行HS-SPME-GC-MS解析，通过计算各组分与内标峰面积和质量浓度的比值构建各香气组分的定量标准曲线，从而计算酒样中各香气物质的含量。

LLME-GC-MS定量香气组分：针对极性较大的酸类物质和HS-SPME回归方程不满足要求的物质利用LLME-GC-MS进行定量分析。分别吸取40 mL不同梯度浓度的标品混合液和酒样到60 mL样品瓶中，加入320 μL的叔戊酸内标(1 197.10 μg/L)和320 μL其他混合内标，用CH2Cl2萃取3次(每次2 mL)，合并有机相后进行冷冻干燥并氮吹浓缩至500 μL。在与1.2.2小节的相同条件下进行GC-MS解析，通过计算各组分与内标峰面积和质量浓度的比值构建各香气组分的定量标准曲线，从而计算酒样中各香气物质的含量。

香气活性组分确定：OAV值为各物质在样品中的含量与其在样品基质下阈值的比值，以此来评价该物质在酒样整体香气中的贡献程度。其中OAV > 1的物质被认为对香气有贡献，OAV > 10的香气物质被认为对酒样的香气有重大贡献[11]。

2 结果与讨论

2.1 兰陵美酒香气轮廓图

采用感官训练的方法，确定了兰陵美酒的7个香气描述词，分别为花果香、蜂蜜、醇香、焦糖、米香、酸香和酱香。在第3轮的训练中，配制香气描述词对应的香气参比样进行感官训练。参照王栋等[9]的方法，选取不同浓度的香气参比样进行训练，强度描述分别为：0表示没有闻到该香气，1～3强度较弱，4～6中等，7～10较强。各香气描述词及对应参照物为：花果香(己酸乙酯)、蜂蜜(苯甲酸乙酯)、醇香(乙醇)、焦糖(葫芦巴内酯)、米香(2-甲基吡嗪)、酸香(乙酸)和酱香(酱油)。经过一段时间的香气强度标准训练，培训品评小组成员样品区分能力、重复性及一致性均较好，接着品评员对兰陵美酒的7个香气属性进行了香气强度的打分，根据打分的结果，制成了兰陵美酒的香气轮廓图。由图1可知，兰陵美酒具有强烈的酱香，香气强度打分达7.2，酸香和焦糖香气强度也较大，分别为5.1和4.9；具有中等的米香，香气强度为3.6；醇香、蜂蜜、花果香较弱，香气强度分别为2.0、1.9、1.8。与其他发酵酒(葡萄酒、啤酒)相比，酱香是兰陵美酒所特有的香气特征描述词。

图1 兰陵美酒香气轮廓特征Fig.1 Sensory profile of Lanling Meijiu.

2.2 兰陵美酒中香气化合物的鉴定

对兰陵美酒进行GC-O-MS解析，其结果如表1所示。根据质谱比对，保留指数比较，香气描述词确定共鉴定出50种香气化合物，最主要的物质是酯类、醇类和酸类。对其平均香气强度进行计算发现，其中香气较为突出的有乙酸异戊酯(香蕉，3.0)，己酸乙酯(果香，4.0)，庚酸乙酯(果香，2.6)，丁二酸二乙酯(花果香，2.8)，异戊醇 (指甲油，3.0)和苯甲醛(杏仁，3.0)。此研究在兰陵美酒中检测到了一些新物质对香气有贡献，如烟酸乙酯(玫瑰、栀子，1.8)，5-羟甲基糠醛(杏仁、坚果，2.0)。

表1 兰陵美酒GC-O-MS闻香结果Table 1 Results of GC-O-MS of Lanling Meijiu.

续表1

各类物质的香气强度比例如图2。可以直观地看出，酯类物质香气强度最大，这和目前文献报道的结论相同。其次，醛类、醇类和酸类香气强度的百分比之和为38%，是贡献香气的第2大物质类群。酚类、吡嗪类、呋喃类、酮类和内酯类香气强度百分比之和为17%，对香气的贡献率较少。但综合来看，具有香气贡献的物质种类达10种之多，更加解释了兰陵美酒香气十分复杂。

图2 兰陵美酒中不同种类化合物香气强度百分比Fig.2 Percentage of aroma intensity of different compounds in Lanling Meijiu.

酯类化合物：通过GC-O-MS解析可确定的酯类物质有15种，其中比较重要的酯类物质有乙酸乙酯(果香、指甲油，3.0)、丁酸乙酯(甜香、果香，2.4)、乙酸异戊酯(香蕉，3.0)、戊酸乙酯(甜香、果香，2.5)、己酸乙酯(果香，4.0)、庚酸乙酯(果香，2.6)、辛酸乙酯(甜香、果香，2.5)、丁二酸二乙酯(花果香，2.8)和乙酸苯乙酯(花香，2.5)。

醇类化合物：通过GC-O-MS可检测到的醇类物质共有8种，其中香气强度较大的有正丁醇(酒香，2.5)、异戊醇 (指甲油，3.0)、苯甲醇(花香，2.1)和苯乙醇(蜂蜜，2.2)。

酸类化合物：通过GC-O-MS可检测到酸类物质共有5种，其中香气强度较大的有戊酸(酸，2.3)和庚酸(脂肪，2.5)。俗话说“无酸不成酒”，酸是酒精饮料中重要的协调成分和呈味物质，是酒精饮料中的骨架成分[12]，可以与其他物质共同作用生成芳香物质，适量的酸赋予酒体协调的口感，同时赋予酒体一定的缓冲能力[13]。

醛酮类化合物：兰陵酒样中共检测到醛酮类物质11种，包括苯甲醛、苯乙醛、5-甲基呋喃醛、2-苯基巴豆醛，其中香气贡献较大的有苯甲醛(苦杏仁，3.0)、苯乙醛(玫瑰，2.5)和香兰素(香草，2.5)。酮类物质香气平均强度值较低，如3-羟基-2-丁酮(奶油，1.5)。

其他类化合物：共检测到呋喃类化合物4种，2(5H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、糠醛和2-正丁基呋喃，香气值较大的有5-羟甲基糠醛(杏仁，2.0)和糠醛(焦糖，2.5)。GC-O闻香结果可知，呋喃类化合物一般具有杏仁和焦糖的香气，属于黄酒香气的一类重要的呈香物质。本研究检测到2种吡嗪类化合物(2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪)的香气值均为2.5，对香气有比较突出的贡献，具有瓜子、果香的香气。近年来关注到的对黄酒有香气贡献的香兰素和香草酸乙酯也被检测到，其香气强度分别为2.5和2.3，由于香气强度值是存在于空气中的感官值，具有强烈的主观性，其具体风味贡献还需结合OAV值的大小来确定。

2.3 兰陵美酒香气物质含量及OAV值分析

GC-O是定位食品中香气物质的有效工具，但这并不能说明这些物质对食品整个香气轮廓的最终结果。主要因为在GC-O分析中，化合物在嗅闻之前被分离和浓缩，但在实际样品中，只有浓度高于样品基质下气味阈值的香气物质才对整体香气有贡献。此外，乙醇含量对香气化合物的挥发性具有重要影响[14]。因此，利用OAV 值可以表征香气组分在黄酒基质中的香气贡献[15]。在OAV值计算中，通过构建标准曲线，对兰陵美酒中香气强度高于2.0的香气组分进行了定量。所定量的香气物质标准曲线线性良好，决定系数(R2)均在0.99以上，同一样品平行3次实验的RSD低于10%，定量方法精确。定量结果表明，兰陵美酒中异戊醇(109 422.52 μg/L)、乙酸乙酯(43 598.05 μg/L)和苯乙醇(47 868.11 μg/L)的质量浓度较高(> 45 000 μg/L)。

为了进一步解析这些香气组分对兰陵美酒总体香气特征的贡献，对其进行OAV计算。如表2所示，共有12个物质OAV > 1(图3)，分别为乙酸乙酯(OAV=3.55)、丁酸乙酯(OAV=38.10)、戊酸乙酯(OAV=1.15)、己酸乙酯(OAV=29.98)、辛酸乙酯(OAV=2.60)、异戊醇(OAV=3.65)、苯乙醇(OAV=5.63)、苯甲醛(OAV=4.66)、苯乙醛(OAV=6.54)、香兰素(OAV=50.73)、γ-壬内酯(OAV=1.61)和4-乙烯基愈创木酚(OAV=3.22)，说明这些香气物质对兰陵美酒香气轮廓有重要贡献。其中，酯类物质是由酸和醇经过酯化反应形成的，主要发生在酒精发酵过程中，在相关酶的催化作用下，酰基辅酶A及脂肪酸和醇类反应生成，主要包括2类：乙基酯和乙酸酯[16]。酯类物质主要呈现果香和花香，在酒精饮料中酯类物质的含量一般不是很高，但因为有其他物质的存在，酯类物质的香气会有所强化[17]，进而对酒体的整个香气的结构和特点产生影响[18]。醇类物质中OAV较高的是异戊醇和苯乙醇，醇类物质可使酒体醇厚丰满，回味绵甜，同时也是酯类化合物的前驱物质[19]，该类化合物主要来自发酵过程中有氧条件下糖的转化及无氧条件下氨基酸的转化而形成[20]。苯甲醛和苯乙醛是兰陵美酒中重要的醛类化合物，分别为兰陵美酒的感官特征贡献了苦杏仁和玫瑰香。苯乙醛阈值较低为25 μg/L，来源于苯丙氨酸的降解[21]，是发酵酒中的重要的香气化合物。香兰素是兰陵美酒中OAV值最高的香气物质，有研究表明，阿魏酸可在微生物的作用下转化为香兰素[22]，而黄酒酿造中所使用的麦曲等原料中含有丰富的阿魏酸，这可能是兰陵美酒中香兰素的主要来源。

表2 兰陵美酒中香气活性化合物的含量及其香气活力值Table 2 Contents of aroma compounds in Lanling Meijiu

图3 兰陵美酒关键香气化合物结构及香气特征Fig.3 Potent aroma-active compounds (OAVs>1) in Lanling Meijiu

3 结论

本文以兰陵美酒为研究对象，通过科学的感官分析，构建了其香气轮廓图，结果表明兰陵美酒的酱香、花果香、醇香和焦糖香比较突出。采用HS-SPME和LLE前处理方法结合GC-O-MS共解析出50种香气组分，其中香气强度较大的有乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、异戊醇和苯甲醛。进一步通过内标法建立标准曲线对这些香气组分进行定量和OAV值计算，结果表明对兰陵美酒整体香气特征具有重要贡献的关键香气物质有12种，分别为乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、异戊醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、香兰素、γ-壬内酯和4-乙烯基愈创木酚。本研究科学解析了兰陵美酒中关键香气物质的种类、含量及其香气贡献特征，对于科学认识兰陵美酒香气特征的风味化学本质和产品风味品质控制具有一定的理论意义。