山楂粗糖蛋白对高脂小鼠降脂及抗氧化作用的初步研究

高雪婧，罗思奕，汤凯洁，罗秋水

(江西农业大学 食品学院,江西 南昌,330045)

山楂为蔷薇科植物山楂(CrataeguspinnatifutaBge.)的干燥成熟果实，具有健脾开胃、消食化滞等功效[1]。现代药理学研究证明，山楂具有降血脂作用，能明显降低总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯 (triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，升高高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C) 水平[2-3]，可以用来预防和治疗高血脂，且无副作用。山楂属于药食同源的优质原料，从中已分离鉴别出总黄酮、三萜酸和植物甾醇[4]等多种降血脂活性成分，但目前国内外鲜见有研究其糖蛋白降血脂活性成分。糖蛋白(glycoprotein)是一类糖类与多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白，作为一种糖和蛋白质的复合物，具有多方面的生物活性，如抗氧化[5]、免疫调节作用[6-8]、体外抗肿瘤活性[9]、降血脂[10]等。

随着人们生活水平的提高，膳食结构的改变对人体健康产生了重要影响，高脂血症发生率逐年攀升。通过膳食干预有效调节血脂代谢，提高机体抗氧化酶活性，减少脂质过氧化产物，已成为大众关切的问题[11-13]。本文通过制备山楂粗糖蛋白来探究其对高脂小鼠的降脂及抗氧化能力，以期为开发新型糖蛋白产品的降脂、抗氧化功能提供一定的理论依据，同时也为山楂的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂市售；清洁级KM雌性小鼠(质量：18～22 g)50只，实验鼠维持饲料，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002；食用猪油，四川溢州油脂有限公司；胆固醇、脱氧胆酸钠、丙硫氧嘧啶、吐温-80、丙二醇，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、乙醚等试剂均为分析纯；TC、TG、HDL-C、过氧化氢酶(catalase，CAT)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)，总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量试剂盒，北京普利莱基因技术公司。

1.2 仪器与设备

TGL-20000CR高速台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-3000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；FD-1 真空冷冻离心机，北京博医康技术公司；Multiscan MK3酶标仪，美国Thermo electron公司；旋涡混合器，美国Thermo Scientific公司；BS-100A 自动部分收集器；DW-86 W420 J医用低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 山楂粗糖蛋白样品的制备

新鲜山楂洗净去核，50 ℃烘干后粉碎备用。称取一定质量的山楂粉末，设置超声功率150 W、料液比1∶20(g∶mL)、超声时间30 min，重复3次提取样品，双层纱布过滤，5 000 r/min离心15min除去沉淀，在所得的上清液中加入体积分数75%的乙醇，5 000 r/min离心15 min,重复3次沉淀样品，所得沉淀溶于蒸馏水中，Sevage法去除游离蛋白，离心所得沉淀经真空冷冻干燥得到样品粉末。取样品粉末溶解配制质量浓度为10 mg/mL的溶液，上DEAE-52 纤维素树脂柱，依次用0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mol/L的NaHCO3进行梯度洗脱，收集蛋白质和多糖重叠峰的洗脱液进行透析，真空冷冻干燥得到微红色山楂粗糖蛋白粉末，然后进行Sephadex G-75纯化，再次收集洗脱液真空冷冻干燥得到白色山楂粗糖蛋白粉末，通过考马斯亮蓝法测定波长在595 nm处和苯酚-硫酸法检测波长在490 nm处吸光度的方法[14]，测得山楂粗糖蛋白纯度为69.15%。

1.3.2 高脂乳剂的配制

参考白冰瑶等[12]、胡文兵等[15]方法制备高脂乳剂。油相：20 g猪油、10 g胆固醇、1 g丙硫氧嘧啶、20 mL吐温-80；水相：20 mL丙二醇、2 g脱氧胆酸钠、30 mL蒸馏水。油相加热至融化，将混合充分的水相倒入油相中不断搅拌，充分溶解后冷却至室温，加蒸馏水定容到100 mL，4 ℃保存，使用时水浴回温至37 ℃。

1.3.3 动物分组及建模

50只雌性KM小鼠适应性饲喂3 d后，随机分为5组：空白对照组、高脂模型组、山楂粗糖蛋白低、中、高剂量组。饲养期间小鼠自由饮水、摄食，每日投放等量饲料，饲养温度为室温条件。每天定时灌胃，每周定时称重,每日处理情况见表1。

表1 小鼠分组及每日处理Table 1 Grouping and daily treatment of mice

1.3.4 血清、肝脏采集与处理

灌胃8周后，对小鼠禁食12 h，记录体重，乙醚麻醉后解剖小鼠，心脏采血，4 ℃条件下3000 r/min离心10 min，分离上清液。肝脏称取质量，用生理盐水清洗拭干置于离心管中，-80 ℃下冷藏[16-17]。

1.3.5 小鼠血脂及抗氧化能力测定

根据试剂盒操作测定血清中TC、TG、HDL-C含量及肝组织匀浆中CAT、T-SOD、T-AOC活性和MDA含量。

1.3.6 数据处理

实验数据用平均值±标准差表示，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan新复极差法进行多重比较，Origin Pro 8.5.1软件制图，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 山楂粗糖蛋白对小鼠血脂的影响

高脂乳剂灌胃导致小鼠血脂异常，而山楂粗糖蛋白可改善高脂小鼠血清的TC、TG、HDL-C水平[18-19]。

表2 山楂粗糖蛋白对小鼠血清TC、TG和 HDL-C含量的影响 单位：mmol/L

由表2可知，与空白对照组相比，高脂模型组TC、TG水平极显著升高(P<0.01)，高脂模型组HDL-C水平极显著降低(P<0.01)，表示高脂小鼠已成功建模。同时，与高脂模型组相比，山楂粗糖蛋白剂量组的TC、TG均显著降低,HDL-C水平显著升高(P<0.01)。由此可知，山楂粗糖蛋白能有效改善高脂小鼠血清TC、TG和HDL-C的水平。

2.2 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏抗氧化能力的影响

高脂膳食会增加体内自由基生成量，导致小鼠发生氧化应激，激发脂质过氧化产物的形成，使得肝脏抗氧化酶活性降低[21-22]。

2.2.1 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏CAT的影响

由图1可知，高脂模型组CAT活性远低于空白对照组(P<0.01)，表明高脂乳剂抑制了小鼠体内的CAT活性；与高脂模型组相比，山楂粗糖蛋白低剂量组对CAT活性有一定提高，而中、高剂量组对CAT活性极显著提高 (P<0.01)，由此表明，山楂粗糖蛋白能有效增强高脂小鼠体内CAT活性。

图1 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏CAT活性的影响Fig.1 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on CAT activities in mice liver

2.2.2 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏MDA的影响

由图2可知，高脂模型组MDA活性水平极显著高于空白对照组(P<0.01)，说明在高脂乳剂的诱导下小鼠处于氧化应激状态，致使体内MDA升高[23]；与模型组相比，山楂粗糖蛋白低、中、高剂量组的MDA含量显著降低(P<0.01)，说明山楂粗糖蛋白具有良好的抗氧化性，能起到减弱组织的氧化损伤的程度，清除氧化应激代谢产物的功能。

图2 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏MDA水平的影响Fig.2 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on MDA contents in mice liver

2.2.3 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏T-SOD的影响

由图3可知，与空白组相比，高脂模型组T-SOD活性明显降低(P<0.05)；与高脂模型组相比，山楂糖蛋白低剂量组T-SOD活性明显提高(P<0.05)，而中、高剂量组极显著提高(P<0.01)，表明山楂粗糖蛋白能有效提高小鼠体内的T-SOD活性，具有良好的抗氧化能力。

图3 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏T-SOD活性的影响Fig.3 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on T-SOD activities in mice liver

2.2.4 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏T-AOC的影响

由图4可知，与空白对照组相比，高脂模型组T-AOC 极显著降低(P<0.01)，表示高脂建模组有效降低了机体的总抗氧化能力；与模型组相比，山楂粗糖蛋白中、高剂量组T-AOC极显著提高 (P<0.01)，而低剂量组T-AOC有一定提高，说明山楂粗糖蛋白能有效提升高脂饮食诱导小鼠肝脏中总抗氧化能力。

图4 山楂粗糖蛋白对小鼠肝脏T-AOC活性的影响Fig.4 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on T-AOC activities in mice liver

3 结论与讨论

无论人体还是动物长期饮食高脂食物会引起代谢紊乱，导致血清中TC、TG等升高和HDL-C降低，从而引起肝内脂肪堆积，形成高血脂、脂肪肝等。相关研究表明，高脂血症与高血糖、高血压等有重要关系，且与冠心病的发病关系很密切。同时，高脂膳食会使体内代谢增高产生大量自由基，引起代谢产物MDA含量增大，MDA对细胞具有严重的毒副作用；然而MDA又极易修饰低密度脂蛋白，促使泡沫细胞形成，由此促进动脉粥样硬化等心血管疾病的形成。CAT、T-SOD是体内2种重要的抗氧化酶，正常情况可及时清除体内氧化代谢产物，保护细胞免受伤害。但当人体内氧化应激水平过高时，其活力大幅度下降，引起氧化与抗氧化之间的平衡失调，从而引发一系列代谢性疾病[24-25]。植物来源的抗氧化剂安全且廉价；山楂作为深受大众青睐的原料，具有良好的降脂保健功能和酸甜可口的独特风味，已被加工为山楂片、复合饮料等多种形式的食品[26-29]。目前有关山楂的研究多集中于新产品的配方研制及工艺优化，少有研究其有效成分对于体内的降脂和抗氧化作用，因此，对于其糖蛋白作用机理的研究仍需进一步阐明。

本研究通过连续喂养4周高脂乳剂的方法建立高脂模型小鼠，以空白组作对照，通过连续喂养4周山楂粗糖蛋白低、中、高剂量组来探讨其对高脂模型小鼠肝脏降脂及抗氧化作用。结果表明：山楂粗糖蛋白中、高剂量组TC、TG水平显著升高(P<0.01)和HDL-C水平显著下降(P<0.01)，山楂粗糖蛋白低剂量组TC水平明显升高(P<0.05)、TG水平显著升高(P<0.01)和HDL-C水平显著下降(P<0.01)，说明山楂粗糖蛋白能有效改善高脂小鼠血清TC、TG和HDL-C的水平;山楂粗糖蛋白低剂量组对CAT、T-SOD活性和T-AOC有一定提高，而中、高剂量组显著提高CAT、T-SOD活性和T-AOC (P<0.01)；山楂粗糖蛋白低、中、高剂量组的MDA含量显著提高(P<0.01)；由此说明山楂粗糖蛋白对高脂饮食诱导小鼠具有较好的抗氧化性能。综上所述，山楂粗糖蛋白能有效调节高脂小鼠血脂代谢，提高机体抗氧化能力，并在研究范围内具有显著量效关系，为山楂的综合利用开发提供参考价值。