唾液乳杆菌M18-6体外抗氧化功能评价及其机制探讨

董晨阳，张红星，贾宇，谢远红，刘慧，金君华*

1(北京农学院 食品科学与工程学院，北京，102206)2(食品质量与安全北京实验室(北京农学院)，北京，102206) 3(农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京重点实验室(北京农学院)，北京，102206)

氧化应激是导致机体衰老和与衰老相关疾病的根本原因，可能引起糖尿病、动脉粥样硬化、关节炎、高血脂、心脑血管疾病等多种疾病[1]。近年来，乳酸菌具有抗氧化作用的报道逐步增多，人们对乳酸菌抗氧化功能的认识也在不断深入。KULLISAAR等[2]发现了2株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)E-3、E-18，均能耐受H2O2且对羟自由基(·OH)有较强的清除能力。ZHAI等[3]评价了10株乳酸菌菌株的抗氧化活性，发现植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM 8661菌液表现出较最强的脂质过氧化抑制活性。

乳酸菌主要通过清除细胞及周围的活性氧自由基、螯合金属离子、缓解脂质过氧化、自身抗氧化防御系统调控、调节宿主细胞抗氧化防御系统、调节宿主细胞与抗氧化相关的信号通路等方式发挥抗氧化作用[4-6]。乳酸菌的自身抗氧化防御系统分为酶类系统与非酶类系统，可以通过乳酸菌体内存在的氧化还原调控系统发挥抗氧化作用[7-8]。

目前，国内外已有关于唾液乳杆菌体外抗氧化功能评价的研究，但是关于其抗氧化机制，尤其是结合全基因组序列信息，在分子层面对抗氧化机理的探究却鲜有报道。本研究全面评价了1株唾液乳杆菌M18-6的体外抗氧化功能，检测其无细胞上清液、菌悬液、细胞内容物的体外抗氧化指标，并从菌株基因组中挖掘11个与抗氧化相关蛋白的编码基因，在mRNA水平探讨菌株在H2O2氧化胁迫环境下的分子应答机制。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

(1)试验菌株：唾液乳杆菌M18-6,保藏号为CGMCC 16199。

(2)参考菌株：鼠李糖乳酸杆菌 (LactobacillisrhamnosusGG，LGG)ATCC 53103, 中国农业大学食品科学与营养工程学院保藏。

1.2 材料、试剂

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(货号A001-1-2)、过氧化氢酶(catalase， CAT)试剂盒(货号A007-1-1)、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(货号A005-1-2)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)检测试剂盒(货号A015-2-1)，南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(货号6110A)、TB Green Premix ExTaqⅡ 试剂盒(货号RR820A)、Recombinant DNase Ⅰ试剂盒(货号2270A)，宝生物工程(大连)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、邻二氮菲、FeSO4、H2O2、K3[Fe(CN)6]、FeCl3、亚油酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid solution，TCA)、L-半胱氨酸、盐酸、抗坏血酸盐、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、丁醇等均为国产分析纯。

1.3 体外抗氧化功能评价

1.3.1 样品制备

将菌株以体积分数为2%的接种量接种于MRS肉汤中，37 ℃恒温培养 12 h，传至3代备用。将活化好的菌液，4 ℃下5 000×g离心 10 min，收集上清液，经0.22 μm滤膜过滤所得滤液即为发酵上清液；菌体沉淀重悬于等体积无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.4，下同)中得到菌悬液；菌体沉淀用无菌PBS缓冲液洗涤3次，重悬于无菌 PBS 缓冲液中，调整细菌的浓度为1×109CFU/mL，并用细胞破碎仪400 W 间歇 4 s，破碎 5 min，10 000×g离心10 min，收集上清液为细胞内容物[9]。

1.3.2 DPPH自由基清除能力

将新配制的2 mL 0.1 mmol/L DPPH试剂与1 mL待测样品混合，室温下静置30 min，5 000×g离心10 min，于517 nm处测定上清液的吸光值(A样品)，以去离子水代替样品测定的吸光值(A对照)，以无水乙醇代替DPPH测定的吸光值(A空白)，以去离子水和无水乙醇调零[10]。按照公式(1)计算DPPH自由基清除能力：

(1)

式中：A对照，1 mL H2O+2 mL DPPH；A空白，1 mL无水乙醇+2 mL样品；A调零，1 mL H2O+2 mL无水乙醇。

1.3.3 ·OH清除率

将1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲试剂、2 mL PBS缓冲液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4充分混匀，加入1 mL 体积分数为10%的H2O2和1 mL待测样品溶液，在37 ℃环境下静置90 min， 在波长536 nm处测吸光值为As。用生理盐水替代样品得到的吸光值为Ac，用生理盐水代替H2O2和样品溶液得到的吸光值为Ab[11]。按照公式(2)计算·OH清除率：

(2)

1.3.4 总还原能力

在0.5 mL待测样品中加入0.5 mL PBS缓冲液、0.5 mL 10 g/L K3[Fe(CN)6]，置于50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷却，加入0.5 mL 100 g/L TCA，3 000×g离心5 min，取1 mL上清液，加入1 mL蒸馏水及1 mL 1 g/L FeCl3，混合均匀，在室温下静置10 min，在波长700 nm处测吸光值，蒸馏水做空白管。

配制0～400 μmol/L的L-半胱氨酸盐酸盐，按上述步骤测吸光值，做标准曲线，将样品吸光值带入标准曲线，计算半胱氨酸当量[12]。

1.3.5 亚油酸过氧化抑制率

将1 mL亚油酸的乳化液与0.5 mL PBS溶液混合，加入0.2 mL 0.1 g/L FeSO4溶液、0.02 mL 0.1 g/L 抗坏血酸盐和0.4 mL待测样品，混匀后置于37 ℃水浴反应12 h，向混合液中加入0.2 mL 40 g/L TCA、2 mL 8 g/L TBA和0.2 mL 4 g/L BHT，混匀后在100 ℃水浴中反应30 min，取出后迅速冷却，用2 mL丁醇提取，在532 nm处测定其上清液的吸光值为A样品，用PBS缓冲液代替样品的吸光值为(A空白)[5]。按照公式(3)计算亚油酸过氧化抑制率：

(3)

1.3.6 抗氧化酶类物质活性

用试剂盒测定菌悬液、无细胞上清液、无细胞提取物中GSH-Px、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和CAT的活性以及T-AOC。

1.4 全基因组测序以及抗氧化相关基因信息挖掘

将活化好的菌体交由美吉生物公司，结合2代Illumina Hiseq×10平台及3代PacBio测序平台，进行基因组序列测定，获取菌株基因组完成图[13]。将预测得到的编码基因通过与数据库(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)进行比对进行功能注释。挖掘与抗氧化相关蛋白的编码基因，利用NCBI设计引物，与内参基因引物一同在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 总RNA的提取、cDNA的合成以及RT-qPCR

将2代的菌液以体积分数为2%的接种量分别接种到H2O2浓度为0、0.5、1.0、1.5、2和2.0 mmol/mL 的MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h，取2 mL菌悬液，4 ℃环境下12 000×g离心5 min。采用玻璃珠-酚仿法提取菌体RNA，利用TAKARA Recombinant DNase Ⅰ试剂盒消化DNA，具体方法参考吴思琪等[14]研究。

cDNA合成：利用TAKARA公司的PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录。

RT-qPCR体系：1 μL模板、1 μL上游引物、1 μL下游引物、0.4 μL ROX、0 μL TB GREEN 1和6.6 μL H2O。具体步骤为：95 ℃预变性3 min，扩增循环(95 ℃ 10 s，引物Tm 30 s)，39个循环，对每种目的基因的扩增反应都进行了扩增产物的融解曲线分析。

将cDNA样品的连续稀释后进行实时荧光定量PCR，做标准曲线评估引物扩增效率，扩增效率在1.90～2.05的引物用于后续的mRNA水平检测，利用2-ΔΔCT计算基因表达水平，将内参基因的表达量设定为1[15]。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析,采用t检验分析样品的差异显著性，P<0.05时认为有显著性差异

2 结果与分析

2.1 菌株体外抗氧化能力评价

2.1.1 DPPH自由基清除能力

由图1可知，唾液乳杆菌M18-6的菌悬液、无细胞上清液以及细胞内容物中均有较强的清除DPPH自由基的能力，其中无细胞上清液DPPH自由基清除能力最强(26.9%)，显著高于菌悬液和细胞内容物的清除能力，分别为13.9%和11.75%；无细胞上清液和细胞内容物的DPPH自由基清除能力均显著高于商业菌株LGG的无细胞上清液和细胞内容物，分别为20.2%和9.05% (P<0.05)。结果表明，菌株无细胞上清液中的活性物质能很好地清除DPPH自由基。有研究表明，菌体清除DPPH自由基的能力与菌体代谢产生的胞外多糖有关[16]。

图1 唾液乳杆菌M18-6清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH free radicals scavenging rate of L.salivarius M18-6 注：*表示与同处理组的LGG相比具有显著性差异(P<0.05)(下同)

2.1.2 ·OH清除能力

本实验体系中，·OH由Fenton反应产生，被清除后体系中Fe2+的质量浓度升高，吸光度也相应升高[17]。·OH清除率如图2所示，唾液乳杆菌M18-6的无细胞上清液以及细胞内容物的·OH清除能力分别为61.95%和18.76%，其中无细胞上清液的清除·OH的能力显著高于商业菌株LGG(49.21%) (P<0.05)。与类似研究结果相比较发现，唾液乳杆菌M18-6无细胞上清液的·OH清除能力高于其他乳杆菌。刘少敏[1]研究发现，植物乳杆菌NDC 75017、嗜酸乳杆菌ATCC 14917和植物乳杆菌NCFM的无细胞上清液·OH清除率分别为32.13%、23.65%和17.28%，均低于本实验的唾液乳杆菌M18-6。无细胞上清液中的·OH清除率高，说明菌株在发酵过程中产生了可清除·OH的活性物质。

图2 唾液乳杆菌M18-6的·OH清除率Fig.2 The hydroxyl radical scavenging rate of L.salivarius M18-6

2.1.3 总还原能力

具有抗氧化性的物质可将K3[Fe(CN)6]还原成K4[Fe(CN)6]，再与Fe3+作用生成普鲁士蓝，在700 nm波长具有最大的光度值，以检测普鲁士蓝的生成量作为试样的还原能力[18]。如图3所示，唾液乳杆菌M18-6的菌悬液、无细胞上清液以及细胞内容物中均有较强的总还原能力，与对照菌株LGG持平，分别为371.125、1 448.625和155.29 μmol/L半胱氨酸当量，其中无细胞上清液显著高于菌悬液与细胞内容物(P<0.05)。由结果可知，菌株在发酵过程中产生了还原力强的活性物质，还原能力优于菌体与细胞内容物。

图3 唾液乳杆菌M18-6总还原能力Fig.3 The total reducing capacity of L.salivarius M18-6

2.1.4 亚油酸过氧化抑制能力

亚油酸易发生氧化而形成过氧化物，进而氧化Fe2+为Fe3+，与邻菲罗啉中的SCN-生成络合物，在500 nm处有最大吸光值，吸光值与亚油酸自氧化程度成正比[19]。由图4可知，唾液乳杆菌M18-6具有良好的抑制亚油酸过氧化能力，其中无细胞上清液的抑制亚油酸过氧化能力为71.3%，显著高于商业菌株LGG(54.08%)，也高于同菌株的菌悬液和细胞内容物的抑制亚油酸过氧化能力，分别为31.79%和17.93%。结果表明，菌株无细胞上清液中的活性物质是抑制亚油酸过氧化率的主要因素，部分完整细胞的非酶物质也能够起到一定的作用。

图4 唾液乳杆菌 M18-6抑制亚油酸过氧化率Fig.4 Inhibition rate of linoleic acid peroxidation in L.salivarius M18-6 注：**表示与同处理组的LGG和菌株其他处理组相比 具有显著性差异(P<0.05)

2.1.5 抗氧化酶类物质活性

抗氧化酶类在机体防御活性氧的损伤中扮演着极为关键的角色[19]。如表1所示，唾液乳杆菌M18-6的菌悬液及无细胞上清液中具有GSH-Px活性，且活性显著高于商业菌株LGG(P<0.05)；无细胞上清液中T-SOD活性显著高于商业菌株LGG(P<0.05)；菌悬液中具有CAT活性；无细胞上清液以及细胞内容物中检测出较强的T-AOC。结果表明，SOD与GSH-Px活性主要展现在无细胞上清液中，证明其主要来源于菌体代谢产物；CAT活性主要是由于菌体表面的活性物；菌体无细胞上清液的T-AOC很强，与上文总还原能力结果一致。与类似研究结果相比较发现[20]，对于乳杆菌抗氧化酶类物质的检测，鲜有将这4种酶类同时检测的报道，并且与同类菌株相比较，唾液乳杆菌M18-6的无细胞上清液的SOD、GSH-Px活性也有较强的优势。

表1 M18-6及LGG抗氧化酶类物质活性单位：U/mg

2.2 基因水平分析菌株抗氧化功能机制

2.2.1 抗氧化相关基因的引物设计

硫氧还蛋白系统、谷胱甘肽系统和是乳酸菌细胞内最主要的氧化还原调控系统[1]。硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase， TrxR)和还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)组成[21]。谷胱甘肽系统主要是由还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、GSH-Px、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)以及谷胱甘肽转硫酶(glutathione-S-transferase，GST)组成[22]。

同时，sod、cat等抗氧化酶基因表达出的SOD和CAT能够与过氧化物作用，发生还原反应，实现抗氧化的功能。根据以上抗氧化机理，选择基因注释中与抗氧化功能相关酶的基因，并设计相应引物(表2)。

2.2.2 H2O2胁迫下抗氧化相关基因的转录水平分析

为了探讨唾液乳杆菌M18-6的抗氧化机理，本研究检测了菌株在不同浓度的H2O2胁迫环境下，基因组中11个抗氧化性相关基因(表2所示)在mRNA上表达水平变化(图5)。研究结果显示，各基因均在0.5 mmol/L H2O2胁迫后出现显著表达上调，其中，NADH氧化酶(gene1634)和超氧化物歧化酶基因(sod)在2.5 mmol/L H2O2胁迫下，mRNA表达水平上调最多，分别上调了6.2和4.5倍。硫氧还蛋白系列(trxA1、trxA2、trxA3、trx)4个基因分别在2.5 mmol/L H2O2胁迫下表达上调了3.2、3.8、2.5和3.7倍，3个过氧化氢酶基因(cat1、cat2、cat3)分别上调了2.3、3.3和1.2倍，gene0157基因表达水平在H2O2胁迫下未发生显著变化。推测在分子水平上，M18-6主要通过NADH氧化酶与硫氧还蛋白系统发挥抗氧化作用[23]，并且sod、cat编码的抗氧化。

表2 唾液乳杆菌M18-6基因组中抗氧化功能相关编码基因及其引物设计Table 2 Genome and primer design of L.salivarius M18-6 about antioxidant function-encoding gene

图5 唾液乳杆菌M18-6基因组中抗氧化相关基因在 H2O2胁迫环境下的mRNA表达水平Fig.5 The mRNA expression levels of antioxidant-related genes in the L.salivarius M18-6 genome under H2O2 stress

3 结论

M18-6无细胞上清液的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、亚油酸过氧化抑制能力均显著高于商业菌株LGG，另外，菌株的无细胞上清液中的GSH-PX与SOD活性也显著高于LGG上清液，表明菌株M18-6的无细胞上清液同时具有酶类和非酶类的抗氧化活性物质。

针对唾液乳杆菌M18-6的抗氧化机制探讨结果显示，唾液乳杆菌M18-6可能通过上调NADH氧化酶基因与硫氧还蛋白系统相关基因(gene1634、trxA1、trxA2、trxA3、trx)表达，及激活硫氧还蛋白系统呈现抗氧化作用效果，同时sod和cat基因表达上调，提高SOD、CAT酶量，提高酶活力，发挥抗氧化作用。