白芍总苷通过抑制内质网应激减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

代小兰 竺东杰 陈小丽 李红霞

缺血性脑卒中是临床常见的脑血管疾病，具有较高的致残、致死率和复发率。通过药物溶栓或血管介入手术恢复血流再灌注、挽救缺血半暗带神经元是改善缺血性脑卒中患者预后的关键。但再灌注过程将病理性刺激炎症因子大量释放、诱导缺血半暗带神经元凋亡，破坏血脑屏障通透性而继发血管源性脑水肿等，即脑缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤，是导致缺血性脑损伤加重甚至死亡的重要因素[1-2]。内质网是普遍存在于真核细胞中的一种膜性细胞器，是机体调控炎症反应、细胞凋亡的重要通路[3-4]。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）是从中药白芍中提取的一类活性化合物，具有良好的抗炎、抗凋亡等药理作用[5-6]；能够通过抑制内质网应激减轻心肌I/R 损伤[7]。本实验研究TGP 对大鼠脑I/R 损伤及内质网应激的影响，现将研究结果报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级成年雄性SD 大鼠240 只，8周龄，体质量220～260g，购自宁波大学实验动物中心[SYXK（浙）2019-0005]，动物合格证号：20191106 013。实验前于光照/黑暗12h 交替、温度（25±1）℃、相对湿度（60±10）%的环境中适应性饲养7 天。本实验经中国人民解放军联勤保障部队第906 医院伦理委员会审核通过，审批号：（2019）伦审（062）号。

1.2 药物与试剂 TGP 胶囊（规格：0.3g/粒，批号201904012，含芍药苷不少于104mg）购自宁波立华制药有限公司；尼莫地平片（nimodipine，NMP，规格：30mg/片，批号190527）购自湖南百草制药有限公司。原位末端转移酶标记（TUNEL） 试剂盒购自德国Roche 公司（批号2101401）；肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫（ELISA）试剂盒购自北京索莱宝生物技术有限公司（货号：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；葡萄糖调控蛋白78（GRP78）、磷酸化胰腺内质网激酶（p-PERK）、C/EBP 同源蛋白（CHOP）、核因子-κB （NF-κB）、激活型半胱胺酸蛋白酶-12（Cleaved Caspase-12）、激活型半胱胺酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、β-actin 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司（货号：bs-1219R、bs-23340R、bs-1630R、bs-23217R、bs-1105R、bsm-33199M、bs-0061R）；IgG 二抗购自杭州华安生物技术有限公司（批号G190319）；ECL 显色试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司（批号36208ES60）。

2 实验方法

2.1 动物分组、给药与造模 将240 只SD 大鼠按照随机数字表法分为六组，分别为假手术组，模型组，TGP 低（50mg/kg）、中（100mg/kg）、高（200mg/kg）剂量组和尼莫地平（NMP，15mg/kg）组，每组40 只。造模前7 天开始，TGP 低、中、高剂量组大鼠分别1次/天给予浓度50、100、200mg/mL 的TGP 溶液灌胃，NMP 组1 次/天给予浓度15mg/mL 的NMP 溶液灌胃，假手术组和模型组1 次/天给予生理盐水灌胃，给药剂量均为1mL/kg。除假手术组外，其余各组大鼠均参照甘雨等[8]报道的方法复制脑I/R 大鼠模型：术前12h 禁食、自由饮水，实施麻醉后取仰卧位，沿颈部正中切口，钝性分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，夹闭颈总动脉并结扎颈外动脉后，在颈外动脉切口并插入线栓进入颈内动脉，遇阻力止（深度距颈外、颈内动脉分叉处约18mm），固定线栓，即堵塞大脑中动脉，逐层缝合并消毒；2h 后提拉线栓至遇阻力止，即实现再灌注。假手术组大鼠钝性分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，不做插线栓处理。

2.2 mNSS 评分法进行大鼠神经功能缺损评分 各组随机取10 只大鼠，采用18 分制的改良神经功能缺损评分标准（modified neureological severity scores，mNSS）[9]，由2 名实验人员对每只大鼠独立进行mNSS 评分后取平均值，得分越高则说明神经功能缺损越严重。

2.3 伊文思蓝渗透法检测血脑屏障通透性 mNSS评分完成后，以4mL/kg 剂量通过尾静脉注入浓度2%的伊文思蓝溶液，1h 后麻醉、开胸，经左心室-右心耳通路灌注300mL 生理盐水，断头取右侧大脑、研磨匀浆后，加入3 倍量浓度50%的甲酰胺溶液，60℃孵育24h 后离心（离心半径10cm，转速3000rpm、时间10min）取上清液，通过酶标仪检测610nm 处吸光度值（A 值），根据标准曲线计算伊文思蓝含量，伊文思蓝含量越高则说明血脑屏障通透性越高。

2.4 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法检测脑组织梗死体积 各组再随机取10 只大鼠，麻醉后颈椎处死，断头取脑，去除小脑、脑干后，-20℃冷冻20min 后，沿视交叉水平行方向等距切片（厚度2mm）。置于37℃的1%浓度的TTC 溶液中，避光孵育，每5min 翻动1 次，共30min。染色后观察，灰白色为脑梗死区、红色为正常脑组织区域，拍照后应用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算梗死面积，脑梗死体积（%）=（梗死面积×切片厚度/脑体积）×100%。

2.5 脑组织病理学检查和神经细胞凋亡观察 各组再随机取10 只大鼠，麻醉后开胸，经左心室-右心耳通路依次灌注300mL 生理盐水、300mL 4%多聚甲醛溶液，断头取脑，去除小脑、脑干后，置4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，4μm 厚度连续切片，脱蜡水化后，（1）行常规HE 染色（苏木精染色10min、0.5%盐酸乙醇分化3s、0.5%尹红乙醇染色1min、80%乙醇分化3s 后脱水）、中性树胶封片后通过光学显微镜观察脑组织病理学改变并照相保存；（2）遵照TUNEL 试剂盒操作说明，行TUNEL 染色，50%甘油封片后通过光学显微镜观察神经细胞凋亡状况，细胞核黄褐色为阳性着色；计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：每只大鼠分别取5 张相同脑部位TUNEL 染色切片，由2 名实验人员于显微镜下独立计数细胞总数和凋亡细胞数，取平均值，AI（%）=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。

2.6 脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6 水平检测 取各组剩余的10 只大鼠，麻醉后脊椎脱臼处死，在冰上断头取脑，去除小脑、脑干，加入9 倍量4℃裂解液，研磨匀浆，4℃离心（半径10cm，转速3500rpm、时间5min）取上清液，遵照ELISA 试剂盒操作说明进行处理，通过酶标仪检测TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

2.7 脑组织蛋白表达检测 取脑组织匀浆液，4℃离心（半径10cm，转速6000rpm、时间10min）取上清液，然后4℃离心（半径10cm，转速12000rpm、时间30min）取沉淀，Bradford 法测定总蛋白量后95℃水浴使蛋白变性，然后通过Western blot 法检测蛋白表达：以30μg 总蛋白量上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭1h，TBST 洗膜3 次后滴加目标蛋白和β-actin 一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次后滴加IgG 二抗室温孵育2h，TBST 洗膜3 次后滴加ECL 显色并通过凝胶成像仪形成条带；通过Image J 软件检测条带灰度值，以β-actin 为内参计算目标蛋白相对表达量。

2.8 统计学方法 应用SPSS 17.0 软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较行LSD 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 TGP 对脑I/R 大鼠mNSS 评分和脑组织伊文思蓝渗透量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠mNSS 评分、脑组织伊文思蓝渗透量均显著升高（P均<0.01）；与模型组比较，TGP 中、高剂量组和NMP组mNSS 评分、伊文思蓝渗透量显著降低（P 均<0.01）；与NMP 组比较，TGP 高剂量组mNSS 评分和伊文思蓝渗透量显著降低（P 均<0.01）。见表1。

3.2 TGP 对脑I/R 大鼠脑梗死体积的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积显著增大（P<0.01）；与模型组比较，TGP 中、高剂量组和NMP 组脑梗死体积显著缩小（P 均<0.01）；TGP 高剂量组和NMP 组大鼠脑梗死体积比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3.3 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织病理学改变的影响假手术组大鼠大脑皮质神经细胞形态规则、结构清晰完整，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠大脑皮质神经细胞数量减少，形态呈三角形或多边形，排列不规则，胞膜破裂、边界不清，胞核固缩、深染，空泡化变性，大量炎性细胞浸润等病理改变；与模型组比较，TGP 各剂量组和NMP 组皮质神经细胞上述缺血性病理学呈不同程度减轻，其中TGP 高剂量组皮质神经细胞排列较为整齐、空白变性较少、仅少量炎性细胞浸润，效果优于其他组。见图1。

3.4 TGP 对脑I/R 大鼠神经细胞凋亡的影响 假手术组大鼠大脑皮质可见极少量凋亡神经细胞；与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮质神经细胞凋亡数量明显增多，AI 显著升高（P<0.01）；与模型组比较，TGP 各剂量组和NMP 组大脑皮质神经细胞凋亡数量不同程度减少，TGP 低、中、高剂量组和NMP 组AI显著降低（P<0.05 或P<0.01）；与NMP 组比较，TGP高剂量组AI 显著降低（P<0.01）。见表1、图2。

3.5 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著升高（P 均<0.01）；与模型组比较，TGP 中、高剂量组和NMP 组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著降低（P 均<0.01）；与NMP 组比较，TGP 高剂量组TNF-α、IL-6 水平显著降低（P 均<0.01），两组IL-1β 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3.6 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP 蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP 蛋白表达量显著增加（P 均<0.01）；与模型组比较，TGP 中、高剂量组和NMP 组GRP78、p-PERK、CHOP 表达量显著减少（P<0.05 或P<0.01）；与NMP 组比较，TGP 高剂量组GRP78、p-PERK、CHOP 表达显著减少（P 均<0.01）。见表3、图3。

3.7 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表达量显著增加（P 均<0.01）；与模型组比较，TGP 中、高剂量组和NMP 组NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 表达量显著减少（P<0.05 或P<0.01）；与NMP 组比较，TGP 高剂量组NF-κB、Cleaved Caspase-3 表达显著减少（P<0.01），两组Cleaved Caspase-12 表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4、图4。

表1 TGP 对脑I/R 大鼠mNSS 评分、脑组织伊文思蓝渗透量、脑梗死体积和AI 的影响（）

表1 TGP 对脑I/R 大鼠mNSS 评分、脑组织伊文思蓝渗透量、脑梗死体积和AI 的影响（）

注：假手术组和模型组予生理盐水1mL/kg 灌胃；TGP 低、中、高剂量组予浓度50、100、200mg/mL 的TGP 溶液1mL/kg 灌胃；NMP 组予浓度15mg/mL 的NMP 溶液1mL/kg 灌胃；I/R 为缺血再灌注；mNSS 为改良神经功能缺损评分；AI 为凋亡指数；TGP 为白芍总苷；NMP 为尼莫地平；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与NMP 组比较，cP<0.01

图1 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织病理学改变的影响（HE ×200）

图2 TGP 对脑I/R 大鼠神经细胞凋亡的影响（TUNEL ×200）

4 讨论

脑I/R 过程将病理性刺激炎症因子大量释放而引发系列炎症反应。赵莹等[10]研究发现，脑I/R 后小胶质细胞迅速活化并释放IL-1β，使IL-1β 在脑I/R后1h 即达到峰值，是促进B 细胞和T 细胞活化而触发免疫反应的重要因子，并且IL-1β 能够刺激巨噬细胞、星形胶质细胞、单核细胞等进一步合成与分泌TNF-α 等炎症因子。IL-6 则能够诱导白细胞黏附并造成微循环障碍，引起缺血区细胞损伤。

缺血半暗带神经细胞凋亡是导致缺血性脑损伤进行性加重的重要机制。细胞凋亡过程受多种基因蛋白调控，其中Caspase-3 在Bax、Cleaved Caspase-12、CHOP 等作用下裂解活化后，能够酶解切割细胞结构蛋白、修复蛋白等而破坏细胞内环境稳定，从而参与细胞凋亡启动和执行过程[11]。血脑屏障能够阻止有害大分子物质由血管进入脑组织，对维持中枢神经内环境稳定具有重要意义。血脑屏障通透性升高是血管源性脑水肿的主要原因，而脑水肿是缺血性脑病致残、致死的重要病理基础。研究发现，TNF-α和IL-1β 能够直接破坏血脑屏障结构，并且能够通过激活黏附因子而间接破坏血脑屏障结构[12]。正常生理状态下伊文思蓝在血管内与蛋白结合而不能通过血脑屏障，当血脑屏障结构受损、通透性异常升高时伊文思蓝则可进入脑组织，所以伊文思蓝渗透量能够反映血脑屏障通透性。

表2 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响（）

表2 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响（）

注：假手术组和模型组予生理盐水1mL/kg 灌胃；TGP 低、中、高剂量组予浓度50、100、200mg/mL 的TGP 溶液1mL/kg 灌胃；NMP 组予浓度15mg/mL 的NMP 溶液1mL/kg 灌胃；I/R 为缺血再灌注；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白细胞介素-1β；IL-6 为白细胞介素-6；TGP 为白芍总苷；NMP 为尼莫地平；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与NMP 组比较，cP<0.01

图3 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP 蛋白表达的影响

表3 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP 蛋白表达的影响（）

表3 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP 蛋白表达的影响（）

注：假手术组和模型组予生理盐水1mL/kg 灌胃；TGP 低、中、高剂量组予浓度50、100、200mg/mL 的TGP 溶液1mL/kg 灌胃；NMP 组予浓度15mg/mL 的NMP 溶液1mL/kg 灌胃；I/R 为缺血再灌注；GRP78 为葡萄糖调控蛋白78；p-PERK 为磷酸化胰腺内质网激酶；CHOP 为C/EBP 同源蛋白；TGP 为白芍总苷；NMP 为尼莫地平；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与NMP 组比较，cP<0.01

图4 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织NF-κB、Cleaved Caspase-12、Claeved Caspase-3 蛋白表达的影响

表4 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响（）

表4 TGP 对脑I/R 大鼠脑组织NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响（）

注：假手术组和模型组予生理盐水1mL/kg 灌胃；TGP 低、中、高剂量组予浓度50、100、200mg/mL 的TGP 溶液1mL/kg 灌胃；NMP 组予浓度15mg/mL 的NMP 溶液1mL/kg 灌胃；I/R 为缺血再灌注；NF-κB 为核因子-κB；Cleaved Caspase-12 为激活型半胱胺酸蛋白酶-12、Cleaved Caspase-3 为激活型半胱胺酸蛋白酶-3；TGP 为白芍总苷；NMP 为尼莫地平；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与NMP 组比较，cP<0.01

TGP 为中药白芍的主要有效成分，具有抗炎、抗凋亡等多种生物学活性。NMP 是一种Ca2+通道阻滞剂，能够通过抑制神经细胞凋亡而对脑I/R 损伤起到保护作用，是脑I/R 损伤防治药物研究相关动物实验常用的阳性对照药物[13]。本研究结果显示，经TGP 干预能够显著降低脑I/R 大鼠神经功能缺损评分、伊文思蓝渗透量和脑梗死体积，明显改善缺血区神经细胞形态结构病变和神经细胞凋亡状况，降低TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，并且TGP 高剂量组上述作用优于NMP 组，提示TGP 对脑I/R 损伤具有保护作用，其机制可能与抑制炎症反应和神经细胞凋亡有关。

内质网对维持细胞内钙稳态、蛋白折叠等发挥着重要调控作用。脑缺血及再灌注后，在氧自由基损伤、能量耗竭等病理状态下导致内质网功能障碍，导致未折叠或折叠错误的蛋白产生，刺激内质网启动自我修复机制，即内质网应激，主要通过磷酸化胰腺内质网激酶抑制蛋白合成从而减少未折叠蛋白的产生，上调内质网伴侣蛋白GRP78 表达以修复未折叠蛋白[14]。但是，当折叠错误蛋白过度积累且内质网功能难以修复时，将激活Caspase-12 和CHOP 而启动细胞凋亡程序；因此，短期适度的内质网应激具有保护作用，而长期过度的内质网应激则促进细胞凋亡[15]。刘冲等[16]研究发现，内质网应激能够诱导NF-κB 表达。杜成成等[17]研究发现NF-κB 分子中p65 亚基能够与DNA 特异性位点结合而诱导单核细胞、巨噬细胞大量合成与释放TNF-α、IL-1β、IL-6 等，进而介导炎症反应。本研究结果显示，经TGP 干预能够显著降低脑I/R 大鼠脑组织GRP78、p-PERK、CHOP、NFκB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表达，并且TGP 高剂量组上述作用除Cleaved Caspase-12 均优于NMP 组，提示TGP 对大鼠脑I/R 后炎症反应和细胞凋亡的抑制作用可能与抑制内质网应激相关炎症和凋亡通路有关。

综上所述，TGP 对大鼠脑I/R 损伤具有保护作用，其作用机制可能与TGP 抑制内质网应激相关炎症和凋亡通路有关。氧化应激是脑I/R 损伤的另一重要机制，TGP 是否能够通过抑制氧化应激减轻脑I/R损伤及其与内质网应激的关系，还有待进一步研究。