HILPDA 在胃癌中表达及与肿瘤侵袭迁移的关系

赵雪峰，谭明，赵一杰，檀碧波

在我国，胃癌发病率及病死率均居恶性肿瘤的前列［1］，对健康危害极大，其主要原因在于约80%的患者就诊时已经存在肿瘤的进展转移［2］，因此很难达到根治，这是胃癌复发转移，导致预后差的主要原因之一。胃癌进展迅速的主要原因在于胃癌细胞具有较强的侵袭迁移能力，这种能力使胃癌细胞易于突破基底膜向机体的其他部位进行迁移，这是导致胃癌转移的基础［3］。胃癌转移是一个多基因、多步骤的过程，由于其过程复杂。目前，其具体机制尚不明确。HILPDA 基因也被称为C7orf68、HIG-2、HIG2 基因，在胰腺癌、肝细胞肝癌、神经胶质瘤中表达明显增高［4-6］，促进了肿瘤的进展侵袭，但HILPDA 基因在胃癌中表达情况及意义尚无报道。为了解HILPDA 基因在胃癌进展中的作用机制，本研究应用生物信息学技术检测了HILPDA 基因在胃癌及癌旁组织中的表达情况，进行了预后分析，探讨了HILPDA基因检测的临床价值。进一步验证HILPDA 基因在胃癌细胞中的作用，为确定新的胃癌预后因子及治疗新靶点提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 HILPDA 基因在胃癌及癌旁组织中表达的生物信息学分析 从TCGA〔GDC（cancer.gov）〕数据库中下载胃癌项目的高通量RNA 测序（RNA-seq）患者和临床数据。TCGA 收录胃癌样本407 例，其中包含肿瘤样本375 例和癌旁样本32 例。根据要求筛选符合条件的样本：（1）基因表达量不为0；（2）临床信息完整。筛选后符合要求的样本数为402 例。使用perl 语言对下载筛选后的TCGA 数据进行初步整理，整理为R 语言可读取的矩阵文件，利用R 软件的“limma”包对提取的HILPDA 基因表达量在癌旁组织和肿瘤样本的表达进行差异表达分析。使用箱线图显示HILPDA 基因在癌旁组织和肿瘤样本中的不同表达水平。

1.2 HILPDA 基因与胃癌患者预后的关系 从TCGA数据库下载胃癌临床数据集。使用R 包“survival”和“survminer”进行生存分析。根据HILPDA 基因的表达水平中位数值将胃癌样本分为两个子集，并采用Kaplan-Meier 生存曲线比较相应两子集之间的生存差异。

1.3 HILPDA 在胃癌中GSEA 富集分析结果 选择c2.cp.HALLMARK.V7.4.symbols.gmt 作为参考基因集进行GSEA 分析。通过分析，发现了HILPDA 高表达组和低表达组之间存在生存差异。将每次分析的随机排列次数设定为1 000 次。以HILPDA 表达量作为表型标记。通过P值和归一化富集评分对每个表型中富集的相关信号通路进行排序。在本研究中，基因集合使用了通路富集分析，筛选标准设置为FDR＜0.25 且P＜0.05，分析结果使用R 软件进行可视化。

1.4 一般资料 选取2019—2020 年于河北医科大学第四医院行外科手术的胃癌患者的肿瘤组织及癌旁组织。肿瘤组织取材时去除标本表面坏死溃疡部分，癌旁组织取材时远离肿瘤上下缘＞3 cm。于标本离体后在30 min 内尽快取材，标本均一式两份，一份用于实时定量PCR（qRT-PCR）检测，一份用于蛋白印迹（Western blotting）检测。取材后先置于液氮中，然后转存于-80 ℃超低温冰箱中。35 例患者中男25 例，女10 例。患者年龄35～71 岁，平均（54.4±8.9）岁。按国际抗癌联盟（UICC）第8 版胃癌分期［7］，Ⅰ～Ⅱ期者17 例，Ⅲ期者18 例（由于Ⅳ期患者无并发症时不建议手术，本研究未纳入IV 期胃癌患者）。

1.5 主要试剂 HILPDA、血管内皮生长因子A（VEGFA）、增殖细胞核抗原（PCNA）、周期素依赖性激酶2（CDK2）、高迁移率族盒蛋白2（HMGB2）及内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物序列由上海吉凯生物公司合成。聚合酶链式反应（PCR）试剂及逆转录PCR（RT-PCR）试剂盒购自美国Invirtogen 公司。TaqMan Real-Time PCR 试剂盒为美国Applied Biosystems 公司产品。实时定量PCR 仪（AB-7900 型）购自美国Thermo Fisher 公司。

1.6 qRT-PCR 技术检测HILPDA、VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 基因的表达 按说明用TRIzol 从组织中提取总RNA 并逆转录为cDNA，用SYBR Green I qPCR试剂盒按操作手册说明进行定量PCR 反应。GAPDH 作为内参基因，各基因的表达强度与GAPDH 进行对比。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，63 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共进行45 个循环。实验重复3 次。

2 结果

2.1 HILPDA 在胃癌及癌旁组织中表达差异 对TCGA最新胃癌数据进行差异表达分析，发现HILPDA 在胃癌组织中呈现出明显高表达（2.535±0.903），高于癌旁组织表达（2.225±1.451），差异有统计学意义（Z=11.563，P＜0.001），见图1。

图1 TCGA 数据库的胃癌组织及癌旁组织HILPDA 的表达情况

2.2 HILPDA 表达与胃癌患者预后的关系 HILPDA 低表达组预后好于高表达组（χ2=33.268，P＜0.001），见图2。从TCGA 官网获得胃癌数据集对HILPDA 进行生存分析，并构建了COX 比例风险模型。单因素COX分析显示，年龄、肿瘤分级、远外转移、淋巴结转移、stage 分期和HILPDA 高表达是胃癌的潜在危险因素。此外，多变量COX 分析证实，肿瘤分级、stage 分期和HILPDA 在总生存期中可以独立于其他因素预测肿瘤预后（P=0.031）。见图3。

图2 HILPDA 表达与胃癌患者预后关系的Kaplan-Meier 结果

图3 HILPDA 与胃癌患者预后关系的COX 生存分析结果

2.3 HILPDA 在胃癌中GSEA 富集分析结果 GSEA 结果显示，HILPDA 高表达组中存在乏氧、DNA 修复、凋亡、P53 等通路的基因富集。其中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 等基因与HILPDA 存在共表达，可能在HILPDA 的调控过程中发挥了重要作用。见图4。

图4 HILPDA 高表达组GSEA 富集分析结果

2.4 临床组织中HILPDA mRNA 的表达水平 胃癌组织中HILPDA 表达水平为（0.331 4±0.066 0），在癌旁组织中表达水平为（0.243 0±0.098 2），胃癌组织中HILPDA 表达比癌旁组织增高（t=-4.420，P＜0.001）。胃癌组织中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA表达水平为（0.423 6±0.170 2）（1.013 9±0.305 8）（0.901 9±0.330 5）（1.325 6±0.319 4），在癌旁组织中表达水平为（0.196 0±0.101 5）（0.342 0±0.138 7）（0.576 8±0.181 9）（0.473 2±0.179 1），胃癌组织中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA 表达均比癌旁组织增强（t=6.795，P＜0.001；t=11.838，P＜0.001；t=5.098，P＜0.001；t=13.771，P＜0.001）。

2.5 胃癌组织中HILPDA 表达与临床病理特征之间的关系 HILPDA 表达水平与胃癌组织的患者临床分期和淋巴结转移情况有关（均P＜0.05）。在临床分期晚、有淋巴结转移的组织中HILPDA 表达更高。结果还显示，HILPDA 表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度、分化程度等无关（均P＞0.05）。见表1。

表1 胃癌组织中HILPDA 表达水平与临床病理特征的关系（）

2.6 胃癌组织中HILPDA 与VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 的mRNA 表达的相关性 Spearman 相关分析显示，HILPDA 与VEGFA、PCNA、CDK2 均存在正相关关系（r=0.396，P=0.019；r=0.462，P=0.005；r=0.548，P＜0.001），HILPDA 与HMGB2 未发现明显相关性（r=0.220，P=0.205）。

3 讨论

胃癌易于进展转移，临床大部分胃癌患者就诊时处于进展期，这是胃癌患者治疗效果差、预后差的重要原因［8］。随着近年来靶向治疗的进展，胃癌也有了针对人表皮生长因子受体2（HER-2）阳性肿瘤的靶向药物曲妥珠单抗，并取得了较好的治疗效果［9］。但HER-2在胃癌中的阳性率仅有10%～15%［10］，因此大部分胃癌患者还不能从靶向治疗中获益。因此，需找新的与胃癌进展相关的基因具有重要价值。随着近年来生物信息学技术在医学研究中的广泛应用，研究者可以通过软件对数据库的数据进行分析，从而探讨目的基因的临床意义和相关机制［11］。HILPDA 是一种与乏氧状态下脂代谢调控有关的基因，其作用机制尚不完全明确，但该基因在胰腺癌、肝细胞肝癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中表达增强［4-6］，具有原癌基因特征。HILPDA 基因在胃癌中表达及意义报道还很少见。本研究首先对TCGA数据库的胃癌相关数据及差异基因表达情况进行了分析，发现HILPDA 在胃癌肿瘤中表达明显比癌旁组织增强，且HILPDA 高表达是胃癌患者预后差的标志。其后笔者又收集了于本研究中心手术的35 例胃癌及癌旁组织，检测了组织中HILPDA 的表达，结果发现肿瘤组织中HILPDA 表达水平比癌旁组织增高，与生物信息学结果符合。由于组织收集时间较短，无法确定HILPDA 的预后价值，故分析了HILPDA 表达水平与患者临床病理特征的关系，结果发现HILPDA 在临床分期晚、有淋巴结阳性转移的组织中表达水平更高，这也提示HILPDA在胃癌进展中发挥了重要作用。

为初步了解HILPDA 基因在胃癌细胞中的作用机制，本研究应用GSEA 基因富集分析探讨了HILPDA 高表达组相关的通路和基因。GSEA 是一种针对全基因组表达谱芯片数据的分析方法，将目的基因与预定义的基因集进行比较［12］，从而发现可能与目的基因有关的通路和基因。本研究应用R 软件对胃癌HILPDA 基因的调控进行了GSEA 分析，结果发现HILPDA 高表达组中存在乏氧、DNA 修复、凋亡、P53 等通路的基因富集，通路中VEGFA、PCNA、CDK2、HMGB2 等基因与HILPDA 存在共表达。VEGFA 是调控血管生成的重要基因，在恶性肿瘤的血管生成中发挥了重要作用［13］。PCNA 主要反映肿瘤的增殖状态，在肿瘤中高表达［14］。CDK2 基因是细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的催化亚基，可以促进细胞由静止期向分裂期的转变［15］。HMGB2 基因是高迁移族蛋白家族成员之一，具有促进细胞迁移的能力［16］。这4 种基因均为原癌基因，出现在HILPDA 高表达组提示HILPDA 基因在促进胃癌细胞的增殖和侵袭方面可能发挥了作用。笔者收集的胃癌标本中HILPDA 与VEGFA、PCNA、CDK2 存在正相关，验证了生物信息学的研究结果。但本研究发现HILPDA与HMGB2 基因无明显相关性，这可能与数据来源、数据样本量不同有关，具体情况还需要进一步深入分析。