红参水煎液对斑马鱼血管生长干预作用的实验研究

石秀娟，邱伯雍，魏易洪，吴 琼，邓 兵，汤 诺，周 端，唐靖一

心肌缺血是多种心血管疾病发生发展的重要机制，血管新生可促进血管侧支循环建立，改善心肌血供，是治疗缺血性心脏疾病的重要研究方向[1]。目前认为人参可有效抗心肌缺血，具有很好的心脏保护作用[2]。而作为人参炮制品的红参，是否具有促进血管生长的作用目前尚不清楚。

斑马鱼是一种较好的模式动物，广泛用于各项药理研究中，亦用于血管生长的研究。既往研究发现，生晒参水煎液虽然不能促进斑马鱼正常的血管生长，但在较低浓度时可以抑制血管内皮生长因子酪氨酸酶抑制剂Ⅱ(VEGF receptor kinase inhibitor Ⅱ，VRI)诱导的血管损伤，说明生晒参有一定的促进血管生长作用[3]。本研究以红参为研究对象，建立斑马鱼正常血管生长模型和血管损伤模型，使用红参水煎液进行干预，观察其对血管生长的药理作用，为后续的研究奠定相关基础。

1 材料与方法

1.1 动物 转基因斑马鱼(Fli1a-EGFP)由上海中医药大学附属龙华医院斑马鱼实验室提供，使用自动循环系统进行喂养，方法同文献[3]。

1.2 药物、试剂及仪器

1.2.1 药物 红参饮片购自上海雷允上药业有限公司(批号：1712010)，使用10倍于生药的蒸馏水，大火煎煮至沸腾，小火微沸浓缩后再次加入蒸馏水，纱布过滤后，煎煮浓缩，制备成1 g/mL红参储备液，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 试剂 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司；VRI购自德国Calbiochem公司，用DMSO溶解成50 mmol/L储备液，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 仪器 培养箱购自德国Heraues公司；Ti-U荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红参水煎液对正常斑马鱼模型的作用 选择3～12个月龄的成熟斑马鱼，进食2 h后按照雌雄1∶1或者1∶2放入产卵缸中，用隔板隔开，适应一晚后，第2天亮灯前抽去隔板，使斑马鱼产卵。将受精卵放入装有胚胎培养液(embryo medium，EM)的培养皿中，于28.5 ℃培养箱孵育24 h，选择状态良好的斑马鱼胚胎，显微镊下摄去胚胎卵壳。

红参水煎液各浓度组采用EM水将红参储备液稀释至不同浓度(1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)，按照每孔1 mL加入24孔板后，加入斑马鱼幼鱼每孔8条，空白对照组为1 mL培养液，孵育24 h后更换培养液及药液，继续孵育24 h后荧光显微镜观察肠下血管。

1.3.2 红参水煎液对VRI诱导血管损伤斑马鱼模型的作用 选择在恒温箱中孵育24 h、发育相近的斑马鱼胚胎，用显微镊摄去胚胎卵壳。VRI(50 mmol/L)用EM水稀释至0.2 μmol/mL，按照每孔1 mL加入24孔板后，加入斑马鱼幼鱼每孔8条，空白对照组加入1 mL培养液，VRI组加入1 mL的0.2 μmol/mL VRI，于恒温箱中孵育24 h，24 h后，抽弃原饲养液，红参水煎液各浓度组用EM水将红参储备液稀释至不同浓度(1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)，按每孔1 mL加入24孔板，空白对照组、VRI组各加入1 mL EM水，放回恒温箱中继续孵育24 h后，荧光显微镜观察脊背节间血管。

1.4 观察指标及方法 将孵育好的斑马鱼放置于载玻片上，吸去多余水分，于荧光倒置显微镜下观察血管。正常斑马鱼模型：观察肠下血管条数、交叉及出芽，计算平均出芽数(出芽数/该组斑马鱼数)、平均交叉数(交叉数/该组斑马鱼数)，ImageJ测量血管直径。VRI诱导血管损伤斑马鱼模型：观察脊背节间血管个数(完整血管和缺陷血管)。方法参照文献[3]。

2 结 果

2.1 红参水煎液对斑马鱼肠下静脉的作用 与空白对照组相比，红参水煎液3 μg/mL组、30 μg/mL组、100 μg/mL组平均出芽数明显增多(P<0.01)，红参水煎液各浓度组平均交叉数比较差异无统计学意义(P>0.05)，红参水煎液10 μg/mL组肠下血管直径有所增加(P<0.05)。详见表1、图1。

表1 各组平均出芽数、平均交叉数、血管直径比较

图1 红参水煎液对斑马鱼肠下血管的作用

2.2 红参水煎液对VRI诱导斑马鱼血管损伤模型的作用 与空白对照组相比，VRI组及红参水煎液各浓度组完整血管明显减少，缺陷血管增多，差异均有统计学意义(P<0.01)；与VRI组相比，红参水煎液1 μg/mL组完整型血管有所增多(P<0.05)，红参水煎液3 μg/mL组、10 μg/mL组、30 μg/mL组、100 μg/mL组完整型血管明显增多(P<0.01)，红参水煎液10 μg/mL组、100 μg/mL组缺陷血管明显减少(P<0.01)。详见表2及图2。

表2 各组完整血管、缺陷血管比较(±s) 单位：条

图2 红参水煎液对斑马鱼节间血管的作用

3 讨 论

红参是由人参经高温蒸制等工序加工后得到，在化学成分上较生晒参更为丰富，并产生人参皂苷Rg3等特有的化合物[4]，具有很好的药理作用。在抗疲劳、抗衰老等方面，黄宝亮等[5]发现红参中的精氨酸双糖苷可改善小鼠力竭性游泳所致疲劳及免疫功能，具有抗疲劳及增强免疫的功效；曾露露等[6]使用红参提取物干预D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠，发现红参提取物有明显的抗衰老作用，机制可能与增强机体免疫能力、清除自由基和炎性因子有关。此外，红参还有很多其他功效，如金光日等[7]使用红参水提物对哮喘小鼠气管炎症进行治疗，发现红参水提物可以抑制气管炎症，且可能通过抑制NF-κB p65等核转录因子来调节Th2；金玲等[8]发现红参皂苷Rg5可以降低1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞活性氧族(ROS)和酪氨酸羟化酶表达水平，改善神经细胞氧化应激状态；梁钰彬等[9]发现红参提取物可以促进人脐静脉内皮细胞合成与一氧化氮释放，降低内皮素-1含量，发挥舒张血管作用。由此可见，红参药效的多效性值得深入研究。

促进血管生长是治疗心血管疾病的主要研究方向，而红参是否具有促进血管生长作用的报道不多。本研究在正常斑马鱼模型中发现，红参水煎液虽然不能增加斑马鱼肠下静脉的交叉数，但在一定浓度时可增加肠下静脉的出芽数和增加斑马鱼肠下静脉的直径。而在VRI诱导的血管损伤模型中，使用VRI进行血管损伤模型构建。VRI可以阻断血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信号通路，而后者主要通过VEGF/VEGF受体(VEGFR)通路发挥促进血管生长的作用，是重要的生长因子[10]，亦是重要的干预对象。本研究发现，红参水煎液各浓度均有一定的恢复血管生长的作用，并且10 μg/mL时效果最好。这些结果均说明红参有一定的促进血管生长作用，并且与前期生晒参水煎液比较[3]，红参水煎液促进血管生长的效果似乎更稳定和明显。孙娜等[11]将近20年中国知网、万方、维普等数据库中关于人参及炮制品的文献资料进行总结后发现，在人参加工成红参过程中，产生了红参特有成分，包括人参皂苷Rh2、Rs1等，并使人参在抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老及促进组织血液循环方面的活性增强。张淼等[12]亦认为，人参经过加工炮制后，所含有效成分如皂苷类、挥发油、糖类等均发生复杂变化，并同时伴有新的物质生成。当然，红参与生晒参到底有哪些物质成分差异，其药效有哪些异同还需更多的研究证实，并且此次研究中，红参促进血管生长的药效较生晒参似乎更好，是否与炮制过程中的物质变化有关需要进一步研究。而赵远等[13]建立的大鼠脾气虚证模型，采用生晒参之四君子汤与红参之四君子汤进行观察比较，发现两组均有较好的血管保护作用，但以生晒参更优。这说明红参与生晒参各有治疗侧重点，在临床应用中还是要灵活机变，辨证论治，达到最好疗效。

总之，本研究发现红参具有一定的促进血管生长作用，并且可能与VEGF有关。在后续研究中可以使用小鼠或大鼠进一步进行观察和验证，以得到更强有力的证据。