疫情期间医院配备新型冠状病毒核酸检测设备方案的探讨

袁 勋，顾泽华，邵 蕾

1.上海市中医医院医学装备管理处，上海 200071；2.同济大学附属同济医院编辑部，上海 200065

2020年4月18日，国务院印发了《关于进一步做好疫情期间新冠病毒检测有关工作的通知》，要求三级医院具备独立开新冠病毒检测能力。新型冠状病毒与SARS 冠状病毒是同一类，但不是同一种。2020年1月12日被世界卫生组织命名为2019-nCoV，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。

患者在感染了新型冠状病毒后最为常见的临床表现为咳嗽、发热、气促和呼吸困难等呼吸道症状。较为严重的患者可能导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡的情况。

确诊病例需有病原学证据阳性结果(实时荧光RT-PCR 检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)［1］。

具备新冠疫情检测能力就要求医院具备二级以上实验室，具备核酸检测的能力。

1 核酸检测原理

1.1 原理

除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，核酸是在细胞核里面的一类生物聚合物，是所有已知生命均有的生物化学成分，参与遗传物质保存、繁殖等生化合成和细胞代谢，决定着细胞或机体的性状表现。

病毒作为最简单的一种生物，是由核酸和蛋白质构成。核酸由核苷酸组成，而核苷酸单体由5-碳糖、磷酸基和含氮碱基组成。如果聚合物中核苷酸的5-碳糖是核糖，则形成的聚合物是核糖核酸(简称RNA)；如果5-碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是核糖核酸(简称DNA)。

每一个生物的核酸是不一样的，通过核酸检测就是要确定人身上是否带有病毒，也就是为了检出病毒的携带者。病毒携带者如果有症状的话就是患者，如果没有症状就是无症状感染者。

1.2 核酸检测操作流程

采样→样本包装→样本送检→样本接收→样本保存和管理→核酸检测(样本前处理→核酸提取和加样)→结果判读与报告→检测后样本的处理和保存

1.2.1 采样要求

鼻咽拭子：拭子贴鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入。待拭子顶端到达鼻咽腔后采集拭子，见图1。将拭子头浸入含2～3 mL 病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

图1 鼻咽拭子采集示意图Fig.1 Schematic diagram of nasopharyngeal swab collection

咽拭子：拭子放入无菌生理盐水中湿润(禁止将拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起过敏)，将拭子越过舌根，两侧咽扁桃体、咽后壁上下擦拭至少3 次，见图2。将拭子头浸入含2～3 mL 病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。咽拭子也可与鼻咽拭子放置于同一管中［2］。

图2 咽拭子采集示意图Fig.2 Schematic diagram of pharyngeal swab collection

深咳痰液：要求被采集人员深咳后，将咳出的痰液收集于含3 mL 采样液的50 mL 螺口塑料管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检测前，加入2～3 mL 采样液，或加入痰液等体积的痰消化液。

1.2.2 病毒核酸检测基本要求

实验室按试剂说明书编写试剂准备、病毒灭活、核酸提取、扩增检测、结果分析及报告等的标准操作程序，并在各个区域的操作过程中严格遵照执行。严禁混样检测。

样本前处理要求

(1)在标本制备区的生物安全柜内取出样本，用75%乙醇消毒样本容器。

(2)咽拭子和鼻咽拭子建议病毒灭活后再进行核酸提取。

(3)病毒灭活要求：56 ℃，灭活时间30～45 min。注意：如使用干预灭活，需保证样本管与金属浴管壁密切接触。

(4)对痰液应充分振荡混匀后进行病毒灭活。

(5)痰液如果有浓痰无法吸样时，可尝试进行液化处理，在灭活标本中加入4 倍体积4% NaOH，室温放置10 min，12000 r/min 离心5 min，去上清后加入生理盐水悬浮，12000 r/min 离心5 min，去上清后再用生理盐水悬浮，12000 r/min 离心5 min，去上清后留约200 μL用于核酸提取。

1.2.3 核酸提取和加样要求

(1)核酸提取和加样应在生物安全柜内完成。

(2)为保证人员安全和核酸提取纯度和效率，建议采用基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法。

注意：需选用试剂盒内配套或推荐的核酸抽提试剂。

2 场地要求

2.1 国家实验室设置、设施与环境要求

(1)具备临床基因扩增检验实验室资质、经过备案的生物安全二级及以上实验室等条件。

(2)至少参加1 次室间质评并合格。室间质评结果不合格的，不允许开展新冠病毒检测。

(3)实验室应符合生物安全有关规定，实验室分区应能有效地防止扩增产物和标本间的交叉“污染”。

2.2 医院场地改造要求

按照卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法的通知》(卫办医政发〔2010〕194 号)的要求与实际操作步骤需要建立采样区、试剂准备区、样本制备区、扩增区。检验科将原有的45 m2二级实验室划分为3 个区域(试剂准备区、样本制备区、扩增区)。试剂准备区13 m2，+10 Pa 的主要功能：试剂的制备和贮存、试剂的分装、主反应混合液的制备。样本制备区22 m2，-15 Pa的主要功能：核酸(RNA、DNA)提取、贮存，扩增反应管的制作。扩增区10 m2，-20 Pa 的主要功能：核酸扩增，扩增片段的测定。

采样区设置在发热门诊附近的临时采样篷里。为避免交叉污染，采用全新风空调系统；阴阳角均用圆弧角密封处理；门必须设置自动互锁(机械或电子)，设有专用工作服/衣柜，实验室的门应有可视窗；在实验室内应配备生物安全柜；设置缓冲间，缓冲间为正压；室内压差值需-5 Pa～-20 Pa，见图3。

图3 场地设计安排Fig.3 Space design and layout

3 设备

3.1 按照二级实验室新冠检测要求需要配置设备

与医院实际情况对应，见表1-3。

表1 准备区所需的设备清单Tab.1 A list of equipments required for the staging area

3.2 需采购设备

目前需采购全自动核酸提取仪1 台、全自动核酸检测前处理系统1 台、冰箱2 台、气溶胶吸附器5 台、56 ℃水浴箱1 台。其中自动核酸检测前处理系统最为关键，它是核酸检测过程中的链接环节。

4 核酸检测仪性能对照

以下为各型号的核酸检测仪的参数新冠病毒核酸检测对比，见表4。

4.1 RNA提取方法比较

4.1.1 磁珠法核酸提取

原理：磁珠法中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解，并使与DNA 或RNA 结合的蛋白质变性，DNA 或RNA 游离释放，磁珠可以特异地吸附DNA 或RNA，通过洗涤，去除DNA 或RNA 以外的蛋白质、多糖等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA或RNA，得到纯度和浓度均很高的DNA或RNA［3］。

主要步骤，见图4。优点：(1)能够实现自动化、大批量操作，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对［4］。(2)操作简单、用时短，整个提取流程只有4步：裂解→结合→洗涤→洗脱，大多可以在36～40 min 内完成；(3)安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少；(4)磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大［5］。

表2 标本制备区所需的设备清单Tab.2 A list of equipment required for the specimen preparation area

表3 扩增分析区所需的设备清单Tab.3 A list of equipments required for the amplification and analysis area

4.1.2 硅胶膜吸附法核酸提取

原理：在高盐缓冲液条件下，硅胶膜会吸附核酸，而对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类既不相亲也不吸附，在经过数次缓冲洗涤离心后，吸附在膜上的DNA 或RNA 已经很纯，这时再用适当体积的低盐缓冲液进行洗脱。

主要步骤，见图5。优点：吸附DNA的硅胶膜可以长期保存，为了避免DNA 的降解，在整个DNA 提取和保存的过程中操作快速、简便、廉价。

表4 各型号的核酸检测仪的新冠病毒核酸检测试剂信息Tab.4 Novel coronavirus nucleic acid test reagents of different types of nucleic acid detectors（first approved）

4.2 阳性判断Ct值

Ct 值是指在实时监测扩增过程中的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。一般情况下Ct 值越大越好。

图4 磁珠法核酸提取步骤Fig.4 Steps for nucleic acid extraction by magnetic bead method

图5 硅胶膜吸附法核酸提取步骤Fig.5 Steps for nucleic acid extraction by silica gel membrane adsorption method

4.3 灵敏度

灵敏度=荧光采集增量/检测样本增量。单位样本采集越高，灵敏度越高，核酸检测准确率也越高。结合以上3点，之江生物的核酸检测仪较为优秀。

5 采购方案

5.1 设计采购方案

明确建设核酸检测能力的方法后，针对我院实际情况做出2套方案。

方案一(备注：设计方案时国家卫健委未发布公告规定必须双靶点及以上)：

采购全自动核酸检测分析系统，直接出检测报告。现有检验科2级实验室条件下不用改动房屋设施，见表5。

表5 方案一情况表Tab.5 Scenario 1

方案二：

原有二级实验室加装一台全自动核酸提取仪+基因扩增仪PCR(医院现有设备)，见表6。

表6 方案二情况表Tab.6 Scenario 2

5.2 确认采购方案

我科室与临床科室开会讨论，从效率、成本、合规性，安全性这4 个主要的方面对以上2 套方案进行比较。

5.2.1 合规性

方案一：上海仁度单靶点检测，与第5期新冠疫情要求双靶点以上检测有出入，不符合要求。之江生物Autrax 全部条件都符合。方案二：全部条件都符合，临床科室已确认。

上海仁度不符合国家卫健委的要求因此不再作考虑。

5.2.2 安全性

方案一：之江Autrax 全程不开盖操作，风险较低。方案二：之江AutraMic 全程不开盖操作，风险较低；硕世到PCR 端需要重新加样，风险较高；达安、PE、圣湘不开盖操作，风险较低。硕世需人工开盖操作，风险较高，因此不再作考虑。

5.2.3 效率

方案一：之江Autrax 为一体机，无需PCR，样本直接检测，全程无泄露，需等待88 个样本再同时检测。方案二：为全自动核酸提取仪+PCR，一天检测两次，需要等待60-80样本再同时检测，检测后需要消毒，影响新冠检查工作及时性，要准备大量患者等候区域。优点在于试剂可以开放，疫情结束后，仍可检测乙肝，丙肝等。

5.2.4 场地

方案一：之江Autrax 符合现有场地情况。方案二：之江AutraMic、PE 符合现有场地情况。达安、圣湘设备体积较大，不符合现有场地情况。

图6 核酸检测结果报告Fig.6 Nucleic acid test report

综上所述，结合效率、合规性、场地与临床科室意见等总体考虑，由于PE 没有现货，需等待2 个月，最终将方案二之江全自动核酸提取仪之江AutraMic +PCR 确定为最优方案。并需额外采购5台气溶胶吸附器，放置在采样点，PCR实验室。

在此次疫情期间，如何尽快实现医院的新冠病毒核酸检测能力是各家医院的头等大事。只有了解病毒原理，通过场地合理布局，产品性能比较，流程安全评估，设备及时采购，才能确保新冠病毒检测工作的顺利实现。

以下是各项工作完成的时间节点：

2020年4月18日，通知下达后，院内任务布置，展开实地调研。

2020年5月31日，场地及设备配备到位，性能验证完毕。

2020年6月4日，满分通过上海市临床检验中心审核，见图6。

2020年6月5日，静安区办理核酸登记。

2020年6月10日，拿到实验室备案凭证。