星点设计-效应面法优选陈皮健脾固体饮品的提取工艺

罗春花，冯露星，唐雨菲，李明慧，覃小丽，陈卫卫

广西中医药大学（南宁 530200）

中医理论认为，脾胃为气血生化的源泉，脾为后天的根本，后天是元气之本，元气是身体健康的基础[1]。陈皮具有理气健脾、燥湿化痰的保健功效[2]；而莲子可健脾益肾、养心安神[3]，两者合用具有健脾祛湿、理气安神等保健效果，使脾胃生化有力、气血充足，可改善气虚体质状态。目前保健固体饮品已成为继碳酸饮料、瓶装水、果汁饮料之后迅速发展起来的一种健康饮品。此款饮品是通过引进多学科交叉技术经加工、调配（或不调配）等工艺制成的固体饮品，具有体积小、携带和运输方便、包装简易、冲水速溶、饮用方便、易于保持卫生等特点，能满足普通大众甚至不健康人群保健养生的不同需求，故开发前景广阔。试验以陈皮、莲子为主料，采用适宜技术最大程度提取功效成分、保留甘甜口感、去除不良气味，拟开发出一款具有健脾祛湿、理气安神等保健效果的固体饮品。陈皮、莲子均属食药两用植物，长期合理食用，不会产生急性、亚急性或者慢性危害，可满足健康或亚健康人群“治未病”的需要。

在不改变传统提取方法的基础上，并考虑工业大生产的实际操作、成本等因素，故仍采用水煎煮法提取。橙皮苷为陈皮的主要有效成分，可反映该饮品的保健效果。故试验以橙皮苷含量和橙皮苷在干膏中质量分数作为评价指标，以提取时间和加水倍数作为考察因素，用星点设计-效应面法优选陈皮健脾固体饮品的最佳提取工艺，具有实际意义，可为后续该产品的开发提供理论依据。

1 仪器、设备与试药

1.1 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）；101-2型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；CPA225D电子天平（北京赛多利斯系统仪器有限公司）；UPC-II-10T超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；HWS-8型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；98-1-B型电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究所，批号：110721-201617）；药材购自广西仙茱中药科技有限公司，由广西中医药大学宁小清高级实验师鉴定，符合《中国药典》2015年版一部要求；高效液相使用色谱纯试剂，其余为分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 橙皮苷的测定

2.1.1 色谱条件

ODS-2 HYPERSIL色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，等度洗脱（洗脱程序如表1所示），流速为1.0 mL/min，检测波长为283 nm，柱温为30 ℃。

表1 流动相等度洗脱程序

2.1.2 对照品溶液的制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量浓度为0.4 mg/mL的橙皮苷对照品溶液，即可。

2.1.3 供试品溶液的制备

按处方量称取药材1份，加入10倍水，煎煮法提取1 h/次，共提取2次，滤过，合并滤液，定容。取适量滤液至离心管中，放至13 000 r/min高速离心机中离心，离心完成后，用洁净的注射器吸取上清液，用0.22 μm水相微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

按处方称取除陈皮外其他药材，依“2.1.3”项下方法制备缺陈皮的阴性对照溶液。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 标准曲线的制备

精密吸取“2.1.2”项橙皮苷对照品溶液1，2，3，4，5和6 μL，分别注入高效液相色谱仪，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X）（μg）为横坐标，根据峰面积结果绘制标准曲线，并求得橙皮苷的线性回归方程：Y橙皮苷=2.00×106X-17 072（r=0.999 9）。结果说明橙皮苷进样量在0.400 0～2.400 0 μg范围内具有良好的线性关系。

2.1.5.2 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液（缺陈皮），按“2.1.1”项下的色谱条件进行测定。由图1结果可知，对照品溶液中橙皮苷的色谱峰与供试品溶液中橙皮苷的色谱峰的出峰位置一致，阴性对照液色谱图中在橙皮苷色谱峰位置不出峰，表明阴性对照液（缺陈皮）中无橙皮苷含量测定的干扰成分。结果见图1。

2.1.5.3 精密度试验

取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.1.2”项下的色谱条件连续进样6针，测定峰面积。结果显示，色谱峰面积的RSD值为0.50%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.1.5.4 重复性试验

按处方量称取药材，按“2.1.3”项方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，并计算RSD。结果显示，橙皮苷含量平均值为0.632 4 mg/g，RSD值为1.85%（n=6），表明提取方法重复性良好。

图1 陈皮健脾固体饮品的提取工艺专属性试验结果

2.1.5.5 稳定性试验

称取处方量药材1份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，进样体积为5 μL，以相同的方法分别测定供试品溶液的峰面积，测定时间点为0，4，8，12，24和36 h。结果显示，色谱峰面积的RSD为0.98%（n=6），表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.1.5.6 加样回收试验

称取处方量药材9份，对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1和0.5∶1左右，每个比例平行操作3份，按“2.1.3”项下方法制备样品溶液，根据“2.1.1”项下的色谱条件分别进样，测定橙皮苷含量，计算出橙皮苷平均回收率分别为98.67%，93.96%和100.9%，RSD分别为2.44%，2.60%和1.73%。

2.1.5.7 样品含量的测定

按处方量称取3批不同批号药材，按照“2.1.3”项方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”色谱条件，测定峰面积，计算橙皮苷的平均含量。结果得出：橙皮苷的平均含量为12.741 9 mg/g，RSD值为2.60%。

2.2 橙皮苷在干膏中质量分数的测定方法

精密吸取陈皮健脾固体饮品溶液10 mL，置于恒质量的蒸发皿中，水浴加热将药液挥发至不流动状态，105 ℃干燥，置于干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定，直至干膏恒质量成功，并计算橙皮苷在干膏中质量分数。

橙皮苷在干膏中质量分数=M/G×100% （1）式中：M为供试品溶液中橙皮苷总质量，mg；G为供试品溶液的干膏总质量，mg。

2.3 星点试验优化提取工艺条件

2.3.1 试验设计

结合原方的提取方法、单因素试验结果和实际生产经验，采用水煎提取法，将提取次数定为2次，考察因素为加水倍数、提取时间。根据星点设计的原理，每个因素设5个水平，代码值所代表的实际操作物理量见表2。

表2 因素代码水平及对应物理量

试验是以橙皮苷含量和橙皮苷在干膏中的质量分数为评价指标。数据处理方法为“归一值”，各指标均标准化为0～1间的“归一值”，各指标的“归一值”求算几何平均数，得总评“归一值”，即OD=（d1×d2×d3）1/3。对于取值越大越好和越小越好的指标采用Hassan方法进行数学转换求“归一值”，试验所用指标均要求越大越好，转换公式为di=（yi-ymin）/（ymax-ymin）。

2.3.2 星点设计结果

星点设计试验安排及结果见表3。

表3 星点设计试验及结果

2.3.3 模拟拟合

应用Design-Expert 8.0.6进行数据分析，以OD值为指标对各因素进行多元线性回归，拟合方程为Y=-0.800 06+0.083 475X1+2.094 75×10-3X2（r=0.934 6，p＜0.000 1）。从拟合方程的相关系数可知，OD值与2个考察因素之间线性相关性结果不理想，因此该模型不合适，因此选择采用多元二次项拟合分析。多元二次项拟合方程为Y=-1.6174 9+0.158 68X1+0.010 165X2-5.921 90×10-5X1X2-2.495 74×10-3X12-4.022 93×1（r=0.974 8，p＜0.000 1）。结果显示非线性的r值更高，拟合效果更好。

2.3.4 方差分析

由表4可知，多元二项式回归方程失拟检验不显著，说明未知因素对试验结果干扰很小，模型拟合检验高度显著，为成功模型。除X1X2、回归系数不显著外，其他均达到显著水平。

表4 回归模型方差分析结果

2.3.5 效应面优化和预测

采用星点设计软件，得到陈皮健脾固体饮品的提取工艺的三维效应曲面图和等高线图，见图2和图3，由数据处理结果分析可得到优化提取工艺条件为加水量18.24倍、提取时间1.88 h，可预测出总评OD值为0.959 7。鉴于试验操作的可行性，并结合工业大生产的实际操作可行性情况考虑，确定最佳工艺条件为加水量18倍，每次提取2 h，共提取2次。

图2 提取时间与加水倍数对总评归一值影响的三维效应面图

图3 提取时间与加水倍数对总评归一值影响的二维等高线图

2.3.6 提取工艺的验证试验

按选取的最佳提取工艺：加水量18倍，每次提取2 h，共提取2次，提取3批样品，结果橙皮苷含量均值为20.300 4 mg/g，橙皮苷在干膏中质量分数均值为30.406 67%，实测OD值为0.997 2，与方程预测值比较，偏差率为-3.91%。表明所建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件稳定性和重现性好。

3 讨论

3.1 提取方法及考察因素的选择

提取中药是一个十分复杂的过程，对药物的提取质量、有效成分的提取率产生影响的因素有很多，例如提取时间、提取溶剂、提取次数、提取温度等，同时也会影响成药疗效[4]。综合考虑能源的损耗、后续放大生产的合理性，故将提取次数定为2次。由于处方为传统经验方，考虑不改变原有煎煮方法，并且结合在大生产过程中需考虑成本等因素，故仍然采用水煎煮法提取。因现有试验条件无法控制提取温度，故选用提取时间和加水倍数作为考察因素。

3.2 评价指标的确定

陈皮健脾固体饮品处方中陈皮为君药，陈皮具有理气健脾、燥湿化痰的功效，其主要含有橙皮苷[5]、柚皮苷和柠檬烯等成分。橙皮苷具有调节免疫力[6]、促胃肠动力[7]等药理活性，能够调节免疫功能，促进胃肠蠕动，从而起到健脾、理气作用。脾胃强健，元气充足，则能有效缓解气虚症状，从而达到治疗气虚体质的效果。故采用陈皮的有效成分橙皮苷含量作为评价指标之一。

同时由于中药复方成分复杂，干膏中含有有效成分及各种杂质成分，故不采用干膏率作为评价指标，干膏率越大不代表提取效果越好，也不代表有效成分含量就越大，因为干膏率大也可能是干膏中杂质成分较多，因此课题采用橙皮苷在干膏中的质量分数作为另一个评价指标，能够更加科学地反映药物提取效果，橙皮苷在干膏中质量分数越大，则干膏中有效成分含量越多，说明提取效果越好。

3.3 数据处理

在试验设计优化法必须完成两方面的工作：①正确描述结果或指标与各考察因素的关系，即建立合适的数学模拟方程。②依据数学方程选取较佳工艺。近年来常用优化工艺试验设计方法有析因设计、正交设计、均匀设计、星点设计-效应面法[8]。

当因素与水平数量过多时，采用析因设计法造成试验次数极高，极耗费人力和时间[9]；采用正交设计法时试验次数会以水平数的平方倍数上升，从而导致在一定周期内试验安排操作难度变大[10]；均匀设计法虽然可减少试验次数，但同时易派生自变量，当自变量个数大于观测点个数，得到的多重线性回归方程不唯一，各结果彼此之间易出现不可抗差异[11-12]。

星点设计-效应面法是一种科学的、简便易学的试验设计优化方法，一般用的是二阶设计，集数学和统计学为一体[13]，能够得出科学、客观的数据结果，星点设计试验次数较正交试验少，且试验设计更为合理，试验精度高，能够直接利用软件进行数据处理，并适用于多因素、多水平的试验[14-16]。此外，能够在软件直接显示试验结果，并对最佳工艺条件进行预测，极大地降低了主观因素对结果的影响。因此，试验采用星点设计-效应面法优选陈皮健脾固体饮品的提取工艺，对最佳提取工艺进行验证，结果表明实际值与预测值偏差在合理范围内，表明该数学模型预测的结果真实可靠，为该产品后续的研究开发及工业化生产提供一定的理论基础，具有实际应用价值。

4 结论

试验采用星点设计-效应面法优选陈皮健脾固体饮品的提取工艺，并结合工业实际生产考虑，确定陈皮健脾固体饮品的最佳提取工艺为加水倍数18倍，提取时间120 min，提取2次。验证试验结果测得总评OD值为0.997 2，与理论预测值接近。表明星点设计-效应面法对陈皮健脾固体饮品的试验指标具有较好的优选性和预测性，所得工艺方法简单、稳定可靠。