米诺环素对腹透管金黄色葡萄球菌生物膜作用体外研究

钟焕，黎伟，廖蕴华

腹膜透析自1932年成功应用以来，已在临床应用80余年之久，仍是治疗慢性肾衰竭的重要方式之一[1]。腹膜炎作为腹膜透析患者最常见严重并发症之一，也是引起技术失败甚至死亡的最重要原因[2]，原因在于反复细菌感染及耐药的发生，与细菌生物膜形成息息相关[3]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)居腹透相关性腹膜炎常见革兰阳性菌第2位，约85%的感染与生物膜(biofilm，BF)密不可分[4]。而要解决生物膜治疗这一棘手难题，就必须设计和研发一种能在菌株有生物膜的情况下仍有良好的活性和渗透性的新型药物。米诺环素属四环素类抗生素，研究表明该类抗生素可用于生物膜感染的预防治疗[5]，而目前国内少有报道米诺环素治疗金黄色葡萄球菌生物膜感染相关案例。本研究通过体外观察米诺环素对金黄色葡萄球菌生物膜起到的作用，为开辟新的腹膜炎治疗策略及临床用药提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 BF体外载体的制备：通过环氧乙烷进行灭菌的腹膜透析管(硅胶材料，美国百特公司生产)裁剪成规格为长1 cm的小段以备用。

1.1.2 实验菌株：由广西医科大学第一附属医院提供的编号为34134的经临床微生物检验中心鉴定的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床菌株作为实验用菌株。

1.1.3 实验相关试剂和仪器：米诺环素(sigma公司产)，1.5%腹膜透析液(美国百特公司生产)、LB肉汤、LB琼脂、Mueller-Hinton肉汤(北京陆桥技术有限责任公司)，戊二醛、硝酸银、对苯二酚、硫代硫酸钠、氯化钙、氯化钠为国产分析纯。生化培养箱(spx-300B-Ⅱ，上海跃进医疗器械厂)、24孔细胞培养板(广州洁特生物公司)、普通光学显微镜(BH22,日本OLYMPAS)、S-800电子扫描显微镜(SEM，日本HITACHI)。

1.2 实验方法 细菌BF体外模型的制备：按文献方法并进行改良，采用腹膜透析液/LB液—腹透管系统进行培养，3 d可培养出早期BF，7 d可培养出成熟BF。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定：采用试管二倍稀释法。参照CLSI(2009年版)，检测米诺环素对实验菌的MIC，平行测定质控菌株ATCC25923。

1.3.2 细菌BF的鉴定：使用银染法进行菌株鉴定。用无菌生理盐水冲洗培养成功的带菌腹透管使未黏附的细菌被洗掉，通过2.5%戊二醛固定1 h，后用5%硝酸银溶液染色，最后以1%对苯二酚溶液进行显色并以5%NaS2O3固定，便可置于显微镜下进行观察。

1.3.3 对细菌BF进行扫描电镜观察：使用2.5%戊二醛固定腹透管，并漂洗于PBS中，之后使用梯度乙醇进行脱水，将金粉在真空中进行喷镀。观察与摄片条件：电压30 kV，放大倍数：3 750。

1.3.4 对早期和成熟细菌BF的作用观察：设置空白对照组(生理盐水组)、1/2MIC米诺环素组、1MIC米诺环素组、2MIC米诺环素组，标本数除生理盐水组为16份外，其他组均为12份。将带菌腹透管予生理盐水多次冲洗去除未黏附细菌后，分别放入每组的试管中，置于恒温37 ℃的环境下进行孵育，每间隔4小时从每组中各拿出腹透管4支，再次行生理盐水多次冲洗并通过连续稀释法开始平板菌落计数。药物作用达到24 h后均对其进行银染和扫描电镜下观察。上述实验操作均进行3遍。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件处理数据，不同浓度米诺环素作用于早期和成熟BF所残留活菌数以及在不同时间段残留数以频数/百分比表示，比较行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 药物MIC的检测结果 药物对实验菌株ATCC25923MIC值均为8 μg/ml。

2.2 银染法鉴定细菌BF 带菌腹透管经冲洗掉的细菌液分别培养3 d与7 d，经过银染，BF呈分布不均的黑褐色棉絮状，而且培养7 d后形成的成熟BF更加稠厚。经药物作用24 h后，无论是早期BF还是成熟BF，1MIC、2MIC米诺环素组团块状、棉絮样的BF明显少于空白对照组。见图1、图2。

注：a 空白对照组，b 1MIC米诺环素组,c 2MIC米诺环素组图1 银染法观察米诺环素对早期BF作用 (银染×1 000)

注：d 空白对照组，e 1MIC米诺环素组，f 2MIC米诺环素组图2 银染法观察米诺环素对成熟BF作用 (银染×1 000)

2.3 扫描电镜观察细菌BF形态变化 培养3 d与7 d，扫描电镜下可见腹透管表面细菌聚集成簇，形成大片块状BF，7 d形成具有立体结构BF，即成熟BF。经药物作用24 h后，无论是早期BF还是成熟BF，1MIC、2MIC米诺环素组与空白对照组相比，BF和菌落体积均有所减少，甚至仅见散在分布单个菌落。见图3、图4。

注：a 空白对照组，b 1MIC米诺环素组,c 2MIC米诺环素组图3 扫描电镜观察米诺环素对早期BF作用 (SEM×3 750)

注：d 空白对照组，e 1MIC米诺环素组，f 2MIC米诺环素组图4 扫描电镜观察米诺环素对成熟BF作用 (SEM×3 750)

2.4 腹透管表面BF内活菌计数 无论是早期BF还是成熟BF，当使用米诺环素4 μg/ml浓度作用于细菌生物膜时，4、8、24 h其BF内的活菌数与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，当继续增加药物浓度至8、16 μg/ml，4、8、24 h时BF内活菌数明显减少，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但至24 h时BF内的细菌仍不能被完全清除，分别见表1、表2。

表1 不同浓度米诺环素对金黄色葡萄球菌早期BF内活菌数影响

表2 不同浓度米诺环素对金黄色葡萄球菌成熟BF内活菌数影响

3 讨 论

腹透液具备高糖和低pH等高渗特性，无疑成为细菌生长的良好培养基，加之腹透管为硅胶材料，吸附性较强，金黄色葡萄球菌易于腹透管表面形成生物膜。一旦生物膜形成，细菌有了多聚基质保护，成功躲避机体免疫系统的攻击及抗菌药物的杀伤，增加细菌耐药性10～1 000倍[6]，且能持续释放细菌，导致腹膜炎反复发作或拔管[7]。针对此，目前国内外重心偏向着力研发能抑制或消除金黄色葡萄球菌生物膜的渗透性良好且有强烈杀菌作用的抗菌素。

糖肽类抗菌药物早前已被全世界公认为治疗金黄色葡萄球菌引起重症感染首选药物，其中最为大家熟知代表为万古霉素，但近年来糖肽类抗生素的耐药性呈上升趋势[8]。研究表明[9]，米诺环素、达托霉素可破坏已形成的BF，并可清除其内部的金黄色葡萄球菌，甚至提出在这方面的作用完全优于万古霉素、替考拉宁。因此大胆设想米诺环素也许是治疗金黄色葡萄球菌感染的不错选择。米诺环素为半合成四环素类，在四环素第7位引进2个甲基，具备高度的亲脂性、较强的组织穿透力及良好的抗菌作用。研究指出[10]，米诺环素对生物膜状态和浮游状态的菌株的抗菌作用强度几乎相同。台湾的研究发现米诺环素还可对已形成的金黄色葡萄球菌生物膜进行破坏并且可及时清除BF内金黄色葡萄球菌[11]。

笔者前期实验成功在体外环境下使腹透管—腹透液系统的金黄色葡萄球菌生物膜模型成功建立，3 d形成早期膜，7 d则为成熟膜。本研究则在此基础上针对不同浓度米诺环素在通过生物膜和杀灭其内菌株的作用进行相关研究。基于传统的MIC治疗策略，实验设置空白对照组(生理盐水组)、1/2MIC米诺环素组、1MIC米诺环素组、2MIC米诺环素组，分别观察其对金黄色葡萄球菌生物膜体外作用。结果显示，无论对早期膜还是成熟膜，当米诺环素浓度为4 μg/ml(即1/2MIC)时，即使延长作用时间至24 h，其BF内的活菌数与空白对照组比较差异无统计学意义，表明此时米诺环素对生物膜毫无作用，而逐渐增加药物浓度至8、16 μg/ml时，4、8、24 h再次通过统计学分析，差异有统计学意义，提示其BF内的活菌数较前减少，表明一旦达到有效浓度，药物可破坏生物膜，且随时间延长其内活菌数有减少趋势。使用药物达24 h后，1MIC、2MIC米诺环素组的早期膜和成熟膜实验样本经过银染法、扫描电镜观察后，所显示的腹透管表面BF体积及菌落数均明显少于空白对照组，再次有力证实这一结果。

综上所述，米诺环素浓度增加，只要达到有效作用浓度或以上，伴随着用药时间的延长，让累积药物浓度逐渐上升，可大幅度减少细菌生物膜和细菌数量，具有强大的杀菌效能，给临床治疗腹透相关性腹膜炎提供又一方便及可行治疗措施，但其作用机制有待进一步研究。同时警惕在临床工作中一旦使用敏感抗生素控制感染，一定使血药浓度和疗程足够充分才能发挥最大效能，否则容易导致更加严重的感染以及诱发细菌耐药。