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氨来呫诺引起肾性尿崩症的机制

2021-01-18刘云涛江攀潘敬芳张琦张军

中国老年学杂志 2021年2期
关键词:髓质饮水量尿量

刘云涛 江攀 潘敬芳 张琦 张军

(1三峡大学附属仁和医院内分泌科,湖北 宜昌 443000;2重庆医科大学附属第三医院心内科;3宣昌市夷陵医院内分泌科)

氨来呫诺(ALX)具有抗炎和抗过敏的作用,目前主要用来治疗复发性口腔溃疡与哮喘等〔1,2〕。动物实验发现ALX可以通过抑制核因子κB抑制物激酶(IKK)ε和Tank结合激酶(TBK)1途径来治疗肥胖、2型糖尿病,可以提高脂肪组织的能量消耗,减轻体重,改善胰岛素敏感性和减少脂肪组织的慢性炎症因子〔3〕,但是其副作用尚未认识,尚未见口服用于临床的报道。我们前期实验发现ALX导致大鼠尿量增多,因此我们探讨ALX诱导肾性尿崩症的(CNDI)机制,这对今后ALX用于临床代谢性疾病治疗是一个警示。同时,如果IKKε参与CNDI的发生,这将是一个良好治疗CNDI的靶基因,为今后的IKK-ε激动剂治疗CNDI提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验材料 IKKε、水通道蛋白(AQP)2引物、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)引物由武汉博士德生物工程有限公司设计合成。一抗、二抗分别购自武汉三鹰生物技术有限公司、武汉博士德生物工程有限公司。逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。大鼠精氨酸加压素(AVP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.2实验方法

1.2.1模型建立与分组 随机选取野生型大鼠(WT)组10只,IKKε基因敲除大鼠(KL)组10只,体重200~220 g。实验大鼠均购自上海南方模式生物科技有限公司,给予普通饲料,喂养于代谢笼单笼、单养,自由饮水和进食,记录尿量和饮水量。稀释后的尿液加入电解质标液Ⅰ,摇匀后进行尿离子含量检测。

1.2.2实验干预 将WT组和KL组大鼠每2只一组,分别给予ALX(购自Cayman chemical公司)20、40、60、80、100 mg/kg灌胃,在ALX灌胃时给予去氨加压素(dDAVP,深圳翰宇药业股份有限公司)1 μg/kg皮下注射〔4〕。于尿量增多24 h后禁水12 h后观察24 h尿量变化。

1.2.3逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IKKε、AQP2 mRNA 核酸蛋白测定仪测定两组大鼠肾脏髓质AQP2 mRNA、WT组IKKε mRNA,取-80℃冰箱中保存的新鲜冰冻肾髓质,重量约为100 mg,按照Trizol一步法提取RNA,测定RNA浓度和纯度。取等量RNA逆转录得到互补脱氧核糖核酸(cDNA)。取适量cDNA进行扩增。引物序列:IKKε上游引物5′-TGTACAAGGCCCGGAATAAG-3′,下游引物5′-CCTCCACTGCGAATAGCTTC-3′。AQP2上游引物:5′-TAGCCTTCTCCCGAGCAGTG-3′,下游引物5′-GCGGAGACGAGCACTTTGACA-3′。

1.2.4Western印迹测定IKKε、AQP2蛋白水平 KL组大鼠肾脏髓质提取AQP2蛋白,WT组大鼠肾脏髓质提取IKKε、AQP2蛋白,用β-actin作为内部对照。用增强化学发光(ECL)检测系统显示辣根过氧化物酶(HRP)耦联抗体产生的信号,在柯达X胶片上曝光。用Bandscan4.3软件进行密度分析,确定蛋白质水平作为频带强度的集成区域(像素)。

1.3统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1ALX诱导CNDI的剂量 ALX 20、40 mg/kg灌胃并不能明显增加大鼠饮水量、尿量和AVP水平(P>0.05),ALX 60、80、100 mg/kg灌胃后较灌胃前两组大鼠饮水量、尿量、AVP水平明显增加(P<0.01,P<0.05);尿比重显著降低(P<0.01),ALX 80、100 mg/kg灌胃与ALX 60 mg/kg灌胃相比较,大鼠尿量、饮水量、尿比重、AVP无显著差异(P>0.05)。见表1。ALX 60 mg/kg灌胃后较灌胃前两组大鼠尿离子含量明显减少(P<0.01)。见表2。

表1 不同剂量ALX灌胃前后WT及KL组大鼠饮水量、尿量、尿比重、AVP水平比较

表2 ALX 60 mg/kg灌胃对尿离子的影响

2.2ALX导致多尿的时间依赖性 在ALX60 mg/kg灌胃同时给予1 d dDAVP皮下注射,注射后24 h和48 h发现两组大鼠尿量及尿比重无明显变化(P>0.05)。ALX导致多尿24 h后禁水12 h,尿量、尿比重没有明显改变(P>0.05)。ALX60 mg/kg灌胃诱导的两组大鼠多尿和低比重尿可持续48 h,从72 h开始尿量逐渐减少,尿比重逐渐增加,至96 h尿量和尿比重接近正常,见表3。

表3 ALX 60 mg/kg灌胃后尿量和尿比重的时间依赖性变化及dDAVP、禁水实验的影响

2.3ALX对肾髓质IKKε、AQP2表达的影响 WT组ALX 60 mg/kg灌胃后IKKε、AQP2的表达显著降低(P<0.05),KL组ALX灌胃后AQP2的表达显著降低(P<0.05)。见表4,图1,图2。

表4 ALX 60 mg/kg灌胃对大鼠肾脏髓质IKKε、AQP2表达的影响

1~4:WT组灌胃前、WT组灌胃后、KL组灌胃前、KL组灌胃后图1 两组ALX灌胃前后AQP2蛋白表达

图2 WT组ALX灌胃前后IKKε蛋白表达

3 讨 论

CNDI是以血浆AVP水平正常或升高,但肾脏不能正常浓缩尿液为特征的疾病〔5〕。本研究结果说明ALX具有诱导CNDI发生的作用。ALX诱导CNDI有时间依赖性。

AQP2是肾脏集合管上的抗利尿激素(ADH)依赖性水通道,主要表达在集合管的主细胞上,选择性地使水分子通过,并在AVP的调节下,于顶膜和储存囊泡之间转换位置,AQP2最重要的功能是介导水的跨膜运输,在尿液浓缩中发挥了重要作用。已证实AQP2基因变异参与了CNDI的发生〔6〕。有研究发现给予大鼠高锂饮食,可通过减少大鼠肾脏集合管AQP2表达减少,诱导CNDI发生〔4〕。研究还发现三苯氧胺可通过上调锂剂诱导的CNDI大鼠集合管AQP2的表达,从而改善多尿症状〔7〕。有学者认为,激活AQP2可能是CNDI的治疗策略〔8〕。这些提示调控AQP2的表达在CNDI的发生具有重要作用。本研究结果提示ALX可能通过对AQP2的影响诱导了CNDI的发生。目前关于药物和其他化合物对AQP2的影响研究十分有限,除了发现锂剂对AQP2的表达具有抑制作用之外,还发现某些对IKKβ具有抑制作用的药物和化合物如氯硝柳胺、血清垂体中叶素(IMD)-0354对AQP2、AQP4具有抑制作用〔9,10〕。而IKKε与IKKβ同属IKK家族,两者具有类似的作用,并且在结构上具有高度相似性〔11〕。ALX是IKKε的特异性抑制剂,本研究进一步证实ALX对IKKε具有抑制作用。ALX诱导CNDI是否与IKKε有关,值得探讨。本研究结果提示ALX诱导CNDI的发生与IKKε的表达降低无关。

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