吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因表达及酶活力的影响

候梦赏，程雪芬，邱园妹，朱雅楠，赵必安，李志国，苏松坤

(福建农林大学动物科学学院蜂学学院，福州，350002)

蜜蜂是重要的授粉性昆虫，在生态环境、农业生产等方面发挥着重要作用(Pottsetal., 2010)。自2006年末北美爆发蜂群崩溃失调症(colony collapse disorder, CCD)以来(Cox-Fosteretal., 2007)，世界其它地区相继出现蜂群数量大幅度减少的不正常现象,(Normanetal., 2010)。大量研究显示，造成这种现象的原因可能包括杀虫剂滥用、寄生虫、病毒、细菌等因素(Watsonetal., 2016; Magaletal., 2019)。新烟碱类杀虫剂是全球使用量最多的品种，除了对靶标昆虫造成神经性损伤以及死亡外，对全球重要授粉昆虫——蜜蜂也具有高毒作用，严重威胁全球农业环境生物安全(Peggetal., 2014)。

新烟碱类杀虫剂的作用机制主要是通过与昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱酯酶竞争受体结合位点，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导(Masaru, 2005)。吡虫啉作为典型的新烟碱类杀虫剂，具有活性高、广谱性的特点，能够导致蜜蜂个体表现出学习能力减弱、寿命缩短、生存活力降低等问题(Armengaudetal., 2004; Carolinaetal., 2015; Zhangetal., 2015; Raymannetal., 2018)；在含有100 μg/kg吡虫啉饲料喂养条件下蜂群群体表现蜂王交替时期过冬能力低下甚至有可能出现盗蜂现象(Ramirez-Romeroetal., 2005)；亚致死剂量吡虫啉能够降低蜜蜂的嗅觉灵敏性(Tanetal., 2017)；影响蜜蜂的定位功能从而弱化归巢能力(Tosietal., 2017)。

近年来已有关于不同剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂影响的相关研究。在低剂量吡虫啉胁迫下，激活蜜蜂解毒基因、免疫基因、抗氧化基因表达(Gong and Diao, 2017)。连续5 d饲喂意大利蜜蜂幼虫含吡虫啉的蔗糖溶液后，幼虫体内多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)表达量显著上调(Tesovniketal., 2019)；连续饲喂意大利蜜蜂0.02 μg/kg吡虫啉7 d后，蜂王体内CPY4G11，CYP6AS14表达显著下调(Chaimaneeetal., 2016)。谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GSTs)、乙酰胆碱酯酶(acetylchoinesterase, AChE)、细胞色素P450(cytochrome P450)、PPO、羧酸酯酶(carboxylesterase，CE)超氧化物歧化酶(SDS)过氧化氢酶(CAT)是蜜蜂体内重要解毒酶，参与蜜蜂对杀虫剂解毒过程，在维持蜜蜂健康方面扮演重要角色(Boasetal., 2018)。然而目前关于亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂影响的研究报道尚少。

本实验旨在探究在低剂量吡虫啉胁迫下，意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因表达情况及免疫解毒酶系活力。探究饲喂含有低剂量吡虫啉蔗糖溶液，对意大利蜜蜂哺育蜂存活率的影响; 以及饲喂含有低剂量的吡虫啉蔗糖溶液后，对意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因PPOA3、ABA、GLD、CYP4506a2、CYB5612-like、UDP-glucuron-osyltransferase的表达量情况；以及饲喂含有低剂量的吡虫啉蔗糖溶液后，对意大利蜜蜂哺育蜂细胞色素P450酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活力的影响。为后续进一步探究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂健康影响的分子机制打下一定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

吡虫啉纯品(Sigma)，丙酮(国药化学试剂有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)，SYBR©Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)，总蛋白提取试剂盒DE101(北京全式金生物科技有限公司)，TaKaRa Bradford Protein Assay Kit(TaKaRa)，昆虫细胞色素P450试剂盒m1036261-J(上海酶联免疫生物有限公司)，昆虫多酚氧化酶PPO试剂盒m1062744-J(上海酶联免疫生物有限公司)，昆虫过氧化氢酶CAT试剂盒ml062687(上海酶联免疫生物有限公司)，昆虫超氧化物岐化酶SOD试剂盒ml036253(上海酶联免疫生物有限公司)，NanoDrop 2000型分光光度计(Thermo Scientific)，梯度PCR仪(Applied Biosystems)，荧光定量PCR仪(BIORAD公司)。

1.2 蜜蜂

试验蜜蜂均取自福建农林大学蜂学学院实验蜂场。从3个蜂群中取3张意蜂子脾，放进限王产卵框中，在恒温培养箱中培养(温度34.5℃，相对湿度70%)，每天使用荧光标记笔标刚出房意蜂，标记后放入蜂群中进行饲养。

抓取哺育蜂(8日龄)，在意蜂饲养盒中饲养，每盒20头意蜂，抓取6盒意蜂(对照组、处理组各3盒)，置于恒温培养箱中(温度30℃，相对湿度70%)用于接受低剂量吡虫啉处理。另抓取8日龄意蜂6盒(每盒20头)，低剂量吡虫啉处理，记录意蜂每天死亡数量，用于测定低剂量吡虫啉对意大利蜜蜂哺育蜂存活率的影响。

1.3 低剂量吡虫啉处理

吡虫啉纯品0.02 g溶于50 mL丙酮中制成400 ng/μL的吡虫啉母液，使用50%蔗糖溶液稀释吡虫啉母液，处理组意蜂饲喂含有0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液，对照组意蜂饲喂含有等量丙酮的50%蔗糖溶液。每天更换蔗糖溶液并清理死亡意蜂。连续处理3 d和9 d后，液氮冻毙收取样本，并将样本放入-80℃冰箱中储存，用于后续免疫、解毒基因表达及酶活力实验。

1.4 提取RNA及cDNA的合成

从对照组、处理组每个日龄样本中各取3头意蜂，使用TRIZOL法提取意蜂总RNA。使用NanoDrop 2000检测RNA浓度并稀释至1 000 ng/μL。配置反转录反应体系(20 μL)：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL；gDNA Eraser 1 μL；总RNA 1 μL；ddH2O 6 μL；42℃反应2 min。然向分别加入：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL；RT Primer Mix 1 μL ；5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL；ddH2O 4 μL；混匀放入PCR仪中37℃，15 min；85℃，5 s；4℃保存。

1.5 荧光定量PCR

在384微孔PCR板上配制如下的反应体系：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 5 μL；PCR上游引物、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL(表1)；DNA模板1 μL；灭菌水3.2 μL，共10 μL反应体系。所有操作在冰上进行，每个样本做3个技术重复。PCR反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s；40个循环；4℃保存。

1.6 免疫解毒酶系活力的测定

1.6.1总蛋白提取

1 mL冰预冷PBS充分清洗蜜蜂样本2次，500 g离心5 min，弃上清液；加入1 mL TPEB(Total Protein Extraction Buffer)震荡匀浆，冰上孵育30 min，每隔10 min震荡摇匀一次；4℃，14 000 g离心10 min，收集上清液，保存于-80℃冰箱中。

1.6.2蛋白浓度测定

用PBS缓冲液将BSA Standard solution标准品(2 mg/mL)稀释为1 000、750、500、250、125、25 μg/mL等，取4 μL稀释后的BSA标准品溶液和检测样品溶液加入到96微孔板中；每孔各加入200 μL复温的Bradford Dye Reagent，混匀后在室温下反应5 min；把96微孔板放入酶标仪 595 nm波长下检测，绘制标准曲线，计算样品蛋白质浓度。

表1 本实验所用引物对序列信息

1.6.3酶活力测定

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定意蜂体内CYP450含量，PPO酶活力，CAT酶活力和SOD酶活力，参考试剂盒方法进行酶活力的测定。

1.7 数据分析

使用Origin 9.0软件绘制生存函数Kaplan-Meier对实验结果进行统计分析，构建意蜂的生存曲线图表。本研究以RP49为内参基因，采用比较CT法计算目的基因的相对定量(目的基因表达量=2-△△Ct)，并运用SPSS软件中独立样本T检验对各组意蜂的基因相对表达量及酶活力进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 低剂量吡虫啉对意大利蜜蜂哺育蜂存活的影响

8日龄哺育蜂饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液3 d和9 d后与对照组存活率无显著差异(P>0.05)，表明哺育蜂自由取食3 d和9 d的含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液对其没有造成致死毒性，8日龄工蜂饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液11 d后与对照组存活率有显著差异(P<0.05)，表明长期取食含吡虫啉的蔗糖溶液会对其造成致死毒性。

图1 0.1 ng/μL吡虫啉处理不同时间后意大利蜜蜂哺育蜂的存活率Fig.1 Survival rate of nurse bees of Apis mellifera ligustica after exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for different time注：8日龄意蜂抓出笼养，处理组饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液，对照组饲喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液。图2和图3同。Note：The 8 day-old adult bees were caught and raised in cages. In the treatment group, the bees were fed with 50% (w/v) sucrose solution containing 0.1 ng/μL of imidacloprid ad libitum, while in the control group the bees were fed with 50% (w/v) sucrose solution containing 0.1 ng/μL of acetone ad libitum. The same for Fig.2 and Fig.3.

2.2 低剂量吡虫啉对意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因表达的影响

8日龄哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液3 d后与对照组相比(图2)，CYB5612-like、UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin、Glucosedehydrogenase、PPOA3均出现上调趋势，其中UDP-glucuronosyltransferase2C1、Abaecin与GlucoseDehydrogenase有显著上调趋势(P<0.05)；8日龄哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液9 d后与对照组相比CYB5612-

图2 0.1 ng/μL吡虫啉处理3 d与9 d后意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因的表达Fig.2 Relative expression levels ofimmune and detoxification related genes in nurse bees of Apis mellifera ligustica exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for 3 d and 9 d注：A，CYB561 2-like；B，UDP-glucuronosyltransferase 2C1；C，CYP450 6a2；D，Abaecin；E，Glucose dehydrogenase；F，PPOA3. 图中数据为平均数±标准误差(n=3)，图形柱上星号表示两组间差异显著(P<0.05, T检验)。图3同。Note：Data in the figure are mean±SE(n=3). The single asterisk indicate significant difference (P<0.05) between the two groups by T-test. The same for Fig.3.

like、UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin、Glucosedehydrogenase、PPOA3均出现下调趋势，其中UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin与GlucoseDehydrogenase有显著上调趋势(P<0.05)。

2.3 低剂量吡虫啉对意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒酶系活力的影响

8日龄哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液3 d后与对照组相比(图3)，CYP450含量出现上调趋势，CAT酶与SOD酶活力均有显著下调趋势(P<0.05)；8日龄哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液9 d后与对照组相比，CYP450含量，PPO，CAT与SOD酶活力均有显著下调趋势(P<0.05)。

图3 0.1 ng/μL吡虫啉处理3 d与9 d后意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒酶系活力Fig.3 Specific activity of immune and detoxification in nurse bees of Apis mellifera ligustica exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for 3 d and 9 d 注：A，PPO；B，CYP450；C，CAT；D，SOD.

3 结论与讨论

随着杀虫剂的广泛使用，其对蜜蜂影响的相关研究也逐步增多，杀虫剂不仅影响采集蜂的健康，蜜蜂采集归巢后，杀虫剂还会影响幼虫、内勤蜂、蜂王的健康(Chaimaneeetal., 2016; Gong and Diao, 2017; Tesovniketal., 2019)，哺育蜂在蜂群中扮演重要角色，承担着哺育幼虫、饲喂蜂王的重任，哺育蜂的质量关系到蜂群的群势与健康(Winston, 1991)。本实验主要探究低剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂的影响，实验条件下0.1 ng/μL吡虫啉连续饲喂8日龄意蜂3 d与9 d对意蜂的存活率没有显著影响，连续饲喂11 d对意蜂的存活率有显著影响，与候梦赏(2019)关于吡虫啉对内勤蜂的研究结果相似。本实验进一步说明在实验室条件下，亚致死剂量吡虫啉短期胁迫对意蜂哺育蜂的存活没有显著影响，长期胁迫对意蜂哺育蜂的存活有显著影响。

与哺乳动物不同，昆虫只存在先天免疫，包括体液免疫和细胞免疫。二者在昆虫免疫系统中扮演重要角色，昆虫主要依赖这两类免疫体系抵御外源性致病因子(Kleinoetal., 2014)。蜜蜂通过基因表达、蛋白酶反应，共同参与对农药等外源性物质的代谢(Mohamedetal., 2015；Cizeljetal., 2016)。CYB561 2-like是细胞色素b561家族基因中一员，其主要功能是参与细胞防御机制及应答环境化学物质的刺激(Zamanianetal., 2012)。UDP-glucuronosyltransferase2C1编码的酶在催化过程中，大大提高受体分子的水溶性，促进葡萄糖醛酸从体内的外排，参与体内免疫机制。(Goonetal., 1992)，CYP450基因家族在昆虫生长、发育及防御过程中发挥重要作用(Dereckaetal., 2013)，Abaecin在胁迫状态下能够编码特定抗菌肽，是体液免疫基因家族中重要组成部分。(Evansetal., 2006)；Glucosedehydrogenase能够编码葡萄糖脱氢酶，该酶能够杀死病原菌，参与蜜蜂细胞免疫过程(Cox-Foster and Stehr, 1994)。PPOA3通过转录翻译多酚氧化酶，在蜜蜂生长过程中扮演重要角色(Tesovniketal., 2019)；本实验结果显示0.1 ng/μL吡虫啉饲喂意蜂9 d后UDP-glucuronosyltransferase2C1，CYP4506a2，Abaecin，Glucosedorydrogenase表达量均具有显著下调，这与Tesovnik等(2019)人的研究具有类似的结果。从基因水平揭示亚致死剂量吡虫啉胁迫下，可以引起蜜蜂的解毒代谢机制，长期的接触则会负面影响意蜂的免疫解毒功能，进而影响意蜂的生存健康。此外，吡虫啉与其它生物性致病因子协同作用，加剧对蜜蜂的危害。亚致死剂量吡虫啉胁迫下，意蜂体内微孢子虫感染量显著增加，蜜蜂健康水平下降更显著(Judyetal., 2012)。亚致死剂量吡虫啉胁迫后，瓦螨对蜜蜂健康造成更大的危害，说明在吡虫啉胁迫下蜜蜂免疫机制受到损害，进而影响意蜂的抗螨能力(Tesovniketal., 2019)。

细胞色素P450酶系、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是蜜蜂体内重要的解毒酶系，在抵抗杀虫剂的胁迫中发挥着重要功能。多酚氧化酶参与调节昆虫各种生理活动，包括变态发育、免疫机制等。(Andersen, 2010)，细胞色素P450酶系参与蜜蜂外源解毒，在昆虫生长、发育及防御过程中发挥重要作用(Igaand Kataoka, 2012)。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶二者功能是清除昆虫体内过剩的活性氧，保护机体免遭环境胁迫的危害(Mccord and Fridovich, 1969; Bolter and Chefurka, 1990)，Li等(2017)使用亚致死剂量吡虫啉处理意蜂，在48 h内检测解毒酶系活力的变化，而本实验将检测时间延长到9 d，并且与对照组相比以上4种酶活性均显著下调，进一步说明亚致死剂量吡虫啉胁迫下抑制意蜂解毒酶系活力，导致蜜蜂对吡虫啉的代谢能力下降，大量的吡虫啉蓄积在体内可能会影响蜜蜂的健康和行为表现。蜜蜂在吡虫啉胁迫下出现嗅觉学习障碍，同时研究发现蜜蜂脑部细胞出现相应程度的细胞凋亡和自噬现象，对蜜蜂食欲行为的不同方面都有不良影响，以及对食物分配、嗅觉信息传播和巢内任务协调都有影响。(吴艳艳等, 2014; Lietal., 2019; Carolina Mengoni Goalons and Farina, 2019)

综上，本研究通过存活率、免疫解毒相关基因表达和免疫解毒酶系活力3个层面探索低剂量吡虫啉对意大利蜜蜂哺育蜂的影响。结果表明低剂量吡虫啉胁迫影响意蜂哺育蜂免疫解毒相关基因的表达及免疫解毒酶系活力，长期胁迫影响意蜂生存。亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂行为、代谢和生理影响仍需在自然条件下做进一步研究。