高氧干扰海马区星形胶质细胞的生长发育

赵钰玮，刘光辉，刘永清，王丹丹，张 健

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的神经细胞，保证正常的血脑屏障，为神经元提供足够的

2020-07-14接收

基金项目：安徽省自然基金青年项目(编号：1508085SQH219)

作者单位：1安徽省儿童医院新生儿科，合肥 2300512安徽医科大学第一附属医院高新分院新生儿科 合肥 230022

作者简介：赵钰玮，女，博士，副主任医师，责任作者：zyw3257@sina.com

营养支持，维持脑内神经递质和细胞外离子环境的稳态。中枢神经系统损伤后可能影响神经元的生长发育[1]。氧疗是新生儿急救的重要治疗手段，但高浓度氧可能引起脑损伤，加重中枢神经系统后遗症[2]。 该文通过对日龄6 d新生鼠暴露80%高浓度氧24 h，建立大鼠高氧模型，探讨高氧对未成熟脑内海马不同区域中星形胶质细胞生长发育的影响。

1 材料与方法

1.1 模型制备与实验分组将新生6 d清洁级健康大鼠随机分为高氧组和对照组，每组5～6只。高氧组与哺乳母鼠共置于高氧箱中24 h，采用数字测氧仪(ProOX110，美国BioSpheri公司)持续检测箱内氧气浓度，维持箱内氧气浓度始终80%，对照组与哺乳母鼠置于同室空气中饲养。分别在新生鼠日龄7、14、21 d取材。

1.2 标本的采集和处理将日龄7、14、21 d 新生鼠用10%水合氯醛2.0 ml/只麻醉后，固定于自制的手术木板上，开胸暴露并游离出心脏，经左心室插入灌流针并固定，剪开大鼠右心耳，在大鼠左心室缓慢灌注4 ℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，再灌注4 ℃ 4%多聚甲醛15 ml，直至大鼠僵直状态，断头取脑，将新鲜脑组织置于4%多聚甲醛浸泡固定24 h后行冰冻切片后行免疫荧光实验。

1.3 免疫荧光技术及图像采集取新鲜脑组织于4%PFA固定1 d后行冰冻切片，PBS离心洗涤2次，10%正常血清封闭10 min，然后滴加GFAP抗体(1 ∶200，Abcam,英国)，4 ℃孵育2 h。洗涤后，滴加荧光素标记抗体，37 ℃保温30 min。将和增殖抗体和凋亡抗体免疫荧光共染色的切片，再次PBS离心洗涤，10%正常血清封闭10 min后滴加ki67抗体(1 ∶100，Affinity bioscience)或capase 3抗体(1 ∶100，Affinity bioscience)，4 ℃孵育2 h。洗涤后，滴加荧光素标记抗体，37 ℃保温30 min。

所有切片洗涤后，封片，免疫荧光显微镜(Eclipse 80i，日本尼康公司)下观察海马CA1、齿状回(dendategyrus, DG)和hilus区域，选取200倍镜像拍照后采用捷达801D形态学图像分析系统软件进行荧光强度测定。

2 结果

2.1 高氧后新生大鼠海马内星形胶质细胞的生长情况在海马CA1和DG区域高浓度氧刺激后星形胶质细胞在日龄7、14和21 d时均无明显变换。但海马hilus区域对照组新生大鼠海马内星形胶质细胞的荧光强度随日龄增加而逐渐增加，高浓度氧刺激后星形胶质细胞在日龄7和14 d时无明显变化，日龄21 d时星形胶质细胞荧光强度较对照组明显降低，差异有统计学意义(P=0.041)(图1)。

2.2 高氧后新生大鼠海马内星形胶质细胞的增殖情况高氧组海马DG、hilus和CA1区域增殖细胞与星形胶质细胞的荧光强度比值在日龄7 d时较对照组均降低，hilus和CA1区域其荧光比值与对照组比，差异有统计学意义(P=0.036、P=0.040)。高浓度氧刺激后海马DG、hilus和CA1区域其比值在日龄14、21 d时与对照组比较无明显统计学变化(图2)。

2.3 高氧后新生大鼠海马内星形胶质细胞的凋亡情况高氧组海马DG、hilus和CA1区域凋亡细胞与星形胶质细胞的荧光强度比值在日龄7 d时均较对照组降低，但差异均无统计学意义。高氧组海马DG、hilus和CA1区域其比值在14 d和21 d时的变化与对照组比较差异均无统计学意义(图3)。

图1 不同日龄新生大鼠海马DG、Hilus和CA1区星形胶质细胞的变化

3 讨论

该研究通过建立高氧大鼠动物模型，显示24 h 80%高氧引起未成熟脑早期海马hilus和CA1区域星形胶质细胞的增殖障碍，同时还引起未成熟脑早期海马hilus区域星形胶质细胞的迟发性生长障碍。提示短时间的高浓度氧可能对未成熟脑产生一定损伤。但24 h 80%高氧引起未成熟脑海马区域的星形胶质细胞凋亡，可能与高浓度氧损伤时间过短以及海马区域相对于脑内其他区域可能具有一定的抗凋亡能力有关。

图2 不同日龄新生大鼠海马DG、Hilus和CA1区星形胶质细胞的增殖情况

氧气疗法通过给予高浓度氧气吸入氧提高肺泡内的氧分压，改善血氧饱和度，维持良好的呼吸功能，能够及时纠正低氧血症和高碳酸血症，因此，氧疗已经成为治疗早产儿窒息缺氧的重要措施之一。目前已经证实高浓度氧会引起视网膜病变[3]和慢性肺部疾病[4]，同时国内外研究[5-6]提示高浓度氧可能会加重新生儿脑损伤，从而增加神经系统后遗症的发生率。课题组前期实验已证实24 h 80%高氧引起未成熟脑内海马区域神经元细胞和少突胶质细胞神经的早期生长增殖障碍，而本研究也显示24 h 80%高氧引起未成熟脑海马区域的星形胶质细胞的早期生长增殖障碍，因此进一步证实即使24 h短时间高浓度氧同样可能引起早期神经细胞的发育异常。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的神经细胞，保证正常的血脑屏障，提供神经元足够的营养支持，维持脑内神经递质和细胞外离子环境的稳态。在感染、缺氧窒息等病理状态下，活性星形胶质细胞是胶质增生的主要参与者，并且和脱髓鞘病变及轴损伤有密切联系[7]。有研究[5]表明48 h 80%高浓度氧抑制星形胶质细胞的活性，减少其增殖并加重细胞凋亡。本研究中显示24 h 80%高浓度氧引起未成熟脑海马区域的星形胶质细胞的早期增殖障碍，但仅在hilus区域和DG区域的星形胶质细胞的增殖异常差异有统计学意义，可能和海马区域的选择性损伤特点有关[8]。在缺氧缺血性脑损伤中相比较海马其他区域，hilus区域中的hilar神经元以及CA1区域中的椎体神经元极易损伤[8]，本研究中高浓度氧的海马区域损伤也发生在这两个区域。除此以外，高氧引起未成熟脑早期海马hilus区域星形胶质细胞的迟发性生长障碍，提示即使短时间高浓度氧仍可能引起远期神经细胞损伤。

图3 不同日龄新生大鼠海马DG、Hilus和CA1区凋亡情况

有研究[9]显示高氧通过不同的凋亡路径引起未成熟脑内广泛细胞凋亡，但本研究中显示24 h 80%高氧刺激后海马DG、hilus和CA1区域凋亡细胞与星形胶质细胞的荧光强度在早期及成熟期日龄中均较对照组无统计学上的变化，提示24 h 80%高氧并未引起未成熟脑海马区域的星形胶质细胞的凋亡。有学者[10]早在1998年就发现了相似的结果，在暴露大鼠在95%高氧中5 d后发现在脑内基底节和纹状体区域出现细胞凋亡增多，但海马区域无明显细胞凋亡。这些提示未成熟脑内不同区域神经细胞的抗凋亡能力不同，可能海马区域相比较脑内其他区域具有更强的抗凋亡能力。