桦褐孔菌多糖的提取工艺、结构及功能活性研究进展*

2021-01-18黄明飞黄昆仑

中国食用菌 2020年11期

黄明飞，仝涛，2**，黄昆仑，2

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心（中国农业大学），北京 100083）

桦褐孔菌[Inonotus obliquus（Fr.）Pilat]是一种主要生长于白桦树、榆树等树皮上的木腐真菌。主要分布于北半球北纬40°～50°地区，如我国黑龙江省小兴安岭、吉林省长白山和内蒙古等区域及日本北海道、俄罗斯西伯利亚和远东地区、芬兰及波兰等区域[1-2]。休眠体外形为不定性块状，子实体具不孕性，菌丝可耐-40℃的极度低温，随着生长时间的增加其菌落的颜色会逐渐变深，依次为白色、淡黄色、黄色和黄褐色，并在风和阳光等因素的作用下，形态由早期柔嫩的绒毛状逐渐变为为硬实的块状[3]。

约在500年前，俄罗斯、波兰及芬兰等地习惯将桦褐孔菌作为天然药物来预防和治疗癌症、心脏病、肝病及糖尿病等各种难辨或难治的病症[4]。桦褐孔菌的化学成分主要有桦褐孔菌多糖、桦褐孔菌醇、桦褐孔菌素、羊毛甾醇型三萜类、叶酸衍生物、芳香物质、木质素衍生物、单宁及栓菌酸等，其中起主要药理作用的为桦褐孔菌多糖、桦褐孔菌醇、桦褐孔菌素、羊毛甾醇型三萜类和木质素[5]。桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌中的重要活性成分，具有抗糖尿病、调节肠道菌群、治疗炎症、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等多种功能活性，因而在近些年的研究中备受关注[6]。

目前我国的桦褐孔菌资源还未受到足够的重视和有效的利用，随着桦褐孔菌多糖功能活性和结构的深入研究，桦褐孔菌多糖的工业化、产品化将成为必然的趋势。因此，通过对国内外文献中关于桦褐孔菌多糖提取工艺、结构及功能活性的研究结果作一概述，希望能为桦褐孔菌多糖的进一步研究、工业化生产以及相关产品的研发提供一定的理论依据。

1 桦褐孔菌多糖的提取工艺研究

桦褐孔菌多糖提取工艺关系到所获得的桦褐孔菌多糖的质量、纯度及活性。其提取工艺主要涉及提取、纯化、分离、干燥等步骤，因此，对桦褐孔菌多糖提取工艺的研究具有重要意义，能够为桦褐孔菌多糖的工业化生产提供一定的参考。

1.1 桦褐孔菌多糖的提取方法

真菌多糖以天然产物的形式存在，可用于真菌多糖提取的方法繁多，如水提取法、酸提取法、碱提取法、酶解法、微波提取法、超声提取法、超临界萃取法、闪式提取法等，或多种方法联合应用[7]。同一提取方法受样品粒径、提取温度、提取时间、料液比、提取次数、pH等多种因素的影响，因此多糖活性、多糖提取率、功耗也会有所不同。李依韦等[8]在热水浸提桦褐孔菌多糖中结合单因素试验和正交试验研究了料液比、提取温度、提取时间、pH4个因素对桦褐孔菌多糖提取的影响，结果表明4个因素均对桦褐孔菌多糖的提取有显著影响，各因素影响作用的大小排序结果为提取温度>pH>料液比>提取时间。

水提取法和碱提取法是桦褐孔菌多糖2种常用提取方法。张丽霞等[9]通过单因素试验和正交试验优化了桦褐孔菌多糖碱提取法最佳工艺参数为氢氧化钠溶液浓度 0.5 mol·L-1，料液比为 1 ∶30(g∶mL)，提取温度为80℃，在最佳的工艺参数下，桦褐孔菌碱溶多糖的提取率可达3.83%。但由于碱提取法的提取条件较为严格、操作风险和实施难度较大，因此，水提取法使用频率相较碱提取法要更高。

为了提高水提法获得产物的含量，人们经常会采用超声、微波、酶等手段辅助提取。Hwang等[10]比较了传统的热水浸提法和非传统提取方法（超声提取、酶提取、高温高压提取）从桦褐孔菌中提取功能活性物质的差异，研究发现通过高温高压获得的桦褐孔菌多糖含量最高（5.88%），酶提取的桦褐孔菌多糖含量（5.86%）显著高于热水浸提的桦褐孔菌多糖含量（3.81%），超声提取的桦褐孔菌多糖含量最低（3.02%）。但张丽霞等[11]通过对比试验发现超声提取的桦褐孔菌多糖含量（5.03%）高于传统的热水浸提法（3.17%），其超声提取的条件为超声波振荡预处理20 min后60℃恒温水浴抽提2次，料液比为1∶50(g∶mL)，而Hwang等[10]的超声提取的条件为50℃下超声提取2 h，料液比为1∶40(g∶mL)，结果有差异的原因可能是超声提取时间过长导致桦褐孔菌多糖发生降解，从而使超声提取的桦褐孔菌多糖含量低于传统的热水浸提法。

1.2 桦褐孔菌多糖的分离方法

多糖的分离涉及多糖提取液杂质去除，经提取方法获得的多糖提取液往往含有较多的杂质，如蛋白质、色素、无机盐、单糖、寡糖等物质，这些杂质的存在会对多糖的结构、功能活性等方面的研究造成影响。因此，对多糖提取液进行纯化处理是提取工艺中十分关键的步骤。

1.2.1 脱除蛋白质

蛋白质和多糖具有许多类似的特征，如亲水性、结构复杂、组成多样等，并且二者又常以糖蛋白的形式存在，使得从多糖提取液中脱除蛋白质较为困难，在脱除蛋白质的同时会造成一定程度的多糖损失。沙维积法（Sevag法）、三氯乙酸法、盐酸法、酒精变性法、蛋白酶法以及多种方法联用是目前常用的脱蛋白方法，各种方法的具体原理及特点见表1[12]。

王艳波[13]通过试验比较蛋白酶法、三氯乙酸法、沙维积法（Sevag法）、酶法辅助三氯乙酸法4种脱蛋白方法对桦褐孔菌粗多糖脱蛋白处理产生的影响，结果表明酶法辅助三氯醋酸法是最佳脱蛋白方法，具有82.32%的蛋白脱除率和76.13%的多糖保留率。

1.2.2 脱除色素

对多糖溶液进行脱色的方法有许多种，如活性炭脱色、过氧化氢脱色、树脂脱色、氧化铝柱层析、聚酰胺脱色、静态混合器脱色是目前较为常用的脱色方法，但具体试验中脱色方法的选择应考虑色素类型、多糖来源、试验室条件等因素[14]。但应该尽量避免活性炭脱色方法的使用，由于色素被活性炭吸附时多糖也会被吸附，从而造成多糖含量的减少[15]。

表1 常用的脱蛋白方法的原理及其特点Tab.1 Principles and characteristics of common deproteinization methods

玄光善等[16]比较了活性炭脱色、过氧化氢脱色、壳聚糖脱色、聚酰胺脱色4种脱色方法对桦褐孔菌多糖脱色的影响，结果表明4种脱色方法均有效果，其中聚酰胺脱色相对较好，具有89.3%的脱色率和91.7%的多糖保留率。

1.3 桦褐孔菌多糖的纯化方法

多糖的纯化涉及到分离混合多糖，经过提取、纯化后获得的多糖提取物一般为具有多种多糖组分的混合多糖，若想获得均一多糖，还需对混合多糖进行分离。目前有多种分离方法可用于混合多糖分离，如分级沉淀法（季铵盐沉淀法、盐析法、醇沉淀法、金属络合物法）、柱层析分离法（纤维素阴离子交换柱层析、纤维素柱层析、凝胶柱层析和亲和柱层析）、超滤分离法等[20]。其中醇沉淀法是多组分多糖纯化最常用的方法，Du等[21]将体积分数为95%的乙醇加入浓缩多糖上清液中，获得了3种桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharides，IOP）组分，达到体积分数为40%的酒精得到的沉淀命名为IOP40；达到体积分数为60%的酒精得到的沉淀命名为IOP60；达到体积分数为80%的酒精得到的沉淀命名为IOP80。

1.4 桦褐孔菌多糖的干燥方法

不同的多糖干燥方法对真菌多糖的功能活性和理化特性有显著的影响。目前常用的多糖干燥方法有热风干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、红外线干燥、微波干燥等[24]。

Ma等[25]研究比较了冷冻干燥、热风干燥和真空干燥3种干燥方法处理后桦褐孔菌多糖的理化性质和抗氧化性能差异，发现3种干燥方法处理对其多糖的理化性质和抗氧化性能有不同影响。与热风干燥和真空干燥相比，冷冻干燥使桦褐孔菌多糖具有更低的分子量分布、具有三螺旋结构的超支化构象，更高的清除DPPH自由基、降低铁还原力和抑制脂质氧化活性的抗氧化能力。因此，相较于其他干燥方法，冷冻干燥对桦褐孔菌多糖活性的影响较小，能够较大程度保留桦褐孔菌多糖活性，然而在实际的生产操作中也存在着能耗较大的缺点。相信随着冷冻干燥技术的进步，其将在真菌多糖的干燥中会有更多的应用。

2 桦褐孔菌多糖的结构研究

桦褐孔菌多糖是至少由10个小分子单糖构成的高分子质量的糖类化合物，其结构复杂，且结构特征与功能活性关系十分紧密[26]。目前对桦褐孔菌多糖结构的研究主要集中于对多糖组分、相对分子质量、不同糖基的组成比例及其连接情况等一级结构上[28]。

2.1 多糖结构的研究方法

多糖结构的研究主要分为结构特征和构象特征两方面。目前有多种研究多糖结构和构象特征方法，如红外光谱、液相核磁共振（一维和二维）、固体核磁共振、拉曼光谱、气相色谱、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱等方法对结构特征进行分析；采用静态和动态光散射、基于稀释聚合物溶液理论的粘度分析、圆二色分析、原子力显微镜（包括单分子原子力显微镜和基于原子力显微镜的单分子力谱）、荧光相关光谱、核磁共振光谱等方法对构象特征进行分析[29]。

2.2 桦褐孔菌多糖结构的研究现状

目前对于桦褐孔菌多糖结构的研究刚刚起步，研究程度较浅。李娟[30]采用红外光谱法和核磁共振法对桦褐孔菌多糖的结构进行了初步分析，结果表明桦褐孔菌多糖主要由吡喃糖组成，桦褐孔菌发酵产物中的胞外多糖主要构型为α构型，而桦褐孔菌发酵产物中的胞内多糖和桦褐孔菌子实体的多糖主要构型为β构型，发酵胞外多糖的数均分子量为29 kDa～55 kDa，胞内多糖数均分子量为 89 kDa～96 kDa，子实体多糖组分的数均分子量是21 kDa。许泓瑜等[31]通过红外光谱和气相色谱分析，发现桦褐孔菌多糖的糖苷键主要是α型，主要单糖组成及质量分数分别为阿拉伯糖（0.53%）、甘露糖（0.48%）、葡萄糖（10.75%）、半乳糖（2.44%）。玄光善等[32]通过气相色谱分析出桦褐孔菌多糖的单糖组成为鼠李糖（3.84%）、阿拉伯糖（3.69%）、木糖（3.32%）、甘露糖（18.52%）、葡萄糖（27.30%）、半乳糖（28.17%）。目前对部分桦褐孔菌多糖组分的分析结果见表2[33-36]。

表2 桦褐孔菌多糖组分的分析Tab.2 The analysis of Inonotus obliquus polysaccharides components

表2所示，陈义勇[33]用DEAE-SepharosCL-6B柱分离纯化桦褐孔菌多糖后得到4个组分，IOP1为中性多糖，IOP2、IOP3、IOP4为酸性多糖，总分子质量约为157 kDa。张丽霞[34]用DEAE-纤维素和分子筛层析相结合的方法，对热水煮提和乙醇沉淀获得的桦褐孔菌多糖进行分级后得到5个组分：2种中性多糖IOPN-I和IOPN-II，数均分子量分别为3.3 kDa、2.6 kDa；3 种酸性多糖 IOPS-I-A、IOPSI-B 和 IOPS-II-A，数均分子量分别为 3.5 kDa、2.6 kDa、3.1 kDa；对稀碱溶液煮提和乙醇沉淀获得的碱溶桦褐孔菌多糖（alkali soluble Inonotus obliquus polysaccharides，AIOP）进行分级后得到2个组分：2种碱溶性多糖AIOP-I和AIOP-II，数均分子量分别为 3.2 kDa、3.4 kDa。荣芳悦[35]采用 DEAE-52 纤维素柱层析法分离桦褐孔菌多糖，获得了IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和 IOP5共5种均一多糖。Ping等[36]用DEAE-52纤维素柱层析法以及Sephadex G-100柱层析法从水提粗多糖中分离纯化了2种多糖（heteropoly Inonotus obliquus polysaccharides,HIOP），HIOP1-S主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖组成，平均分子量13.6 kDa；HIOP2-S主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成，平均分子量15.2 kDa。

由上述结果可知，目前对桦褐孔菌多糖的糖苷键、单糖组成、组分分析、分子质量等结构的研究结果存在差异，可能是由于影响结构的因素多种多样，如样品产地、样品生长状态、提取方法及纯化方法等，造成所得的纯多糖有不同，从而导致研究结果的差异。

3 桦褐孔菌多糖的功能活性研究

研究结果表明植物多糖具有良好的功能活性，而且对生物体几乎没有副作用，因此吸引了许多科学家从事多糖功能活性的相关研究[37]。通过综合国内外文献，对目前报道的桦褐孔菌多糖的功能活性进行论述。

3.1 抗Ⅱ型糖尿病

Ⅱ型糖尿病是一种常见的因代谢问题而引起的疾病，其特征是机体对胰岛素反应不敏感而导致的慢性高血糖。据国际糖尿病联合会2019年的报道，我国是糖尿病患者最多的国家，共计1.16亿[38]。Wang等[39]以链脲霉素诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠为模型研究时发现，口服桦褐孔菌多糖（900 mg·kg-1小鼠体重）可以显著恢复小鼠的体脂质量，降低空腹血糖水平，提高葡萄糖耐受能力，增加肝糖原水平，改善胰岛素抵抗（P<0.01）。桦褐孔菌多糖可能的抗Ⅱ型糖尿病的机制见图1。

由图 1所示，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）是胰岛素受体底物的靶蛋白，在胰岛素信号转导中不可或缺。激活胰岛素受体底物可以使PI3K的P85调节亚基磷酸化，进而磷酸化下游蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）。磷酸化后的PKB抑制关键酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶）的表达，进而抑制肝脏糖异生，还可促进葡糖糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）向细胞表面转运，刺激肌肉和脂肪组织摄取葡萄糖。

Wang等[40]同样以链脲霉素诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠为模型，探究了桦褐孔菌多糖对糖尿病的影响。结果表明腹腔注射120 mg·kg-1小鼠体重的甲硫胺素和50 mg·kg-1小鼠体重的IO4（50%～80%乙醇沉淀的桦褐孔菌多糖）或IO5（总80%乙醇沉淀的桦褐孔菌多糖），可逆转糖尿病小鼠体重和空腹血糖水平的异常变化，能显著提高血清中胰岛素和丙酮酸激酶水平，促进肝糖原和肌糖原的合成。以上试验结果为桦褐孔菌多糖具有潜在降血糖功能提供了依据。

3.2 调节肠道菌群

多糖作为益生元能够有效抑制代谢性疾病和调节肠道微生物菌群[41]。Hu等[41]研究发现口服100 mg·kg-1～300 mg·kg-1小鼠体重的桦褐孔菌多糖均会影响小鼠的肠道微生物组成和多样性。桦褐孔菌多糖处理组的小鼠肠道菌群的多样性降低，表现为香农（Shannon）多样性指数和Chao1估计量比其他的更低。桦褐孔菌多糖增加了拟杆菌门菌种比例，降低了厚壁菌门菌种比例。拟杆菌门与谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力呈正相关，厚壁菌门与肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β和脂肪酶相关。谷胱甘肽过氧化物酶是一种重要的超氧化物降解酶，被认为是生物体抗氧化能力的指标，而谷胱甘肽过氧化物酶水平的降低在癌症、硬化和慢性胰腺炎患者中普遍存在[42]。

3.3 治疗肠道炎症

炎症性肠病是一种与具有白细胞分化抗原4的T细胞（CD4+T）亚群失衡相关的肠道慢性炎症性疾病[43]。CD4+T细胞的亚种群根据细胞分化和细胞功能的不同可以由辅助性T细胞（Th1、Th2、Th17）和调节性T细胞（Treg）这4种主要的亚种群组成。这些细胞之间的免疫失衡可能是炎症性肠病发病过程中最直接、最重要的因素。Chen等[43]研究发现，作为桦褐孔菌主要活性成分的桦褐孔菌多糖可减轻右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠慢性肠道炎症。口服桦褐孔菌多糖（100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1小鼠体重）可显著降低结肠炎小鼠的疾病活动指数，缓解结肠炎小鼠的病理变化，减少结肠组织中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的丢失，并调节结肠组织、肠系膜淋巴结和脾脏中Th1/Th2和Th17/Treg的失衡。

3.4 抗氧化

机体在生命活动中会不断产生各种活性氧自由基，其具有较高的化学反应性，过多的活性氧自由基易引起部分酶的脂质过氧化和氧化，以及大量蛋白质的氧化和降解，从而引起一系列的疾病，因此药物抗氧化功能的研究备受关注[44-45]。Chen等[46]研究发现桦褐孔菌多糖具有明显的羟自由基、DPPH自由基的消除作用和肝脏脂质过氧化的抑制作用，并呈现出剂量效应。桦褐孔菌多糖的抗氧化能力受多种因素影响，如产地、提取方法等。王晶波等[6]比较了来源于5个地区（俄罗斯、吉林桦甸、黑龙江大兴安岭、吉林长白山、云南香格里拉）的桦褐孔菌的多糖提取率和抗氧化活性的差异，发现多糖的抗氧化能力和多糖提取率紧密相关，其中来自云南和俄罗斯的桦褐孔菌多糖抗氧化能力最强。Zhang等[47]探究了不同的提取方法对桦褐孔菌多糖抗氧化活性的影响，结果表明水溶性多糖的抗氧化活性高于碱溶性多糖。此外，有研究表明，通过化学修饰[48]、物理改性[49]、球磨预处理[50]等方法可以显著提高桦褐孔菌多糖的抗氧化能力。

3.5 抗疲劳

疲劳是一种由于压力和过度的体力脑力劳动而导致身体或精神极度疲劳的感觉[51]。Zhang等[51]研究发现通过DEAE纤维素-52色谱法获得的桦褐孔菌多糖组分（PIO-1）不仅具有延缓身体疲劳的巨大潜力，而且具有改善精神疲劳的潜力。强迫游泳试验结果表明，口服50 mg·kg-1的PIO-1能够增加小鼠的攀爬持续时间和游泳时间以及减少小鼠的不动时间。桦褐孔菌多糖可能的抗疲劳机制见图2。

由图2可知，PIO-1降低了小鼠血乳酸、尿素氮和乳酸脱氢酶的水平，降低了小鼠大脑中5-羟色胺的浓度。血乳酸是在厌氧条件下的糖酵解产物，细胞内乳酸的积累会导致疲劳。血清中尿素氮水平的升高通常代表肌肉收缩力的损伤，过量的尿素氮反映了蛋白质的分解，从而减弱肌肉收缩，引起疲劳。5-羟色胺的强烈释放会抑制节律活动和运动神经元激活，导致中枢疲劳。这些与疲劳相关的代谢参数的变化说明了PIO-1具有延缓身体疲劳和改善精神疲劳的潜力。然而，仍需对PIO-1进行详细的结构描述，以揭示其结构与抗疲劳活性之间的关系。

3.6 抗肿瘤

癌症是经济发达或欠发达国家的主要死亡原因之一。据估计，到2020年，中国将有约451万例癌症病例和304万例癌症死亡病例[52]。Jiang等[53]研究发现桦褐孔菌多糖能够激活肺癌细胞中磷酸腺苷依赖性蛋白激酶，从而在体内外降低癌细胞的线粒体膜电位，诱导癌细胞凋亡。磷酸腺苷依赖性蛋白激酶在维持能量稳态方面起着关键作用。陈义勇等[54]研究发现桦褐孔菌多糖在体内外均对肿瘤细胞的增殖具有很强的抑制作用，能够在体外直接杀死Jurkat肿瘤细胞（人淋巴瘤细胞）和Daudi肿瘤细胞（人淋巴瘤细胞）并表现出了剂量效应，最高的抑制率分别达62.29%和66.42%，同时能在体内杀死肿瘤细胞，大剂量组（100 mg·kg-1的桦褐孔菌多糖）和小剂量组（50 mg·kg-1的桦褐孔菌多糖）对Jurkat肿瘤细胞的抑制率分别为43.52%和57.48%。