Hippo信号通路介导PTEN调节PI3K/AKT/mTOR信号通路影响肝癌细胞增殖能力

徐 瑞,李丽娜,王文娟

(1陕西省肿瘤医院内一科,西安 710061;2西安交通大学第一附属医院肿瘤内科;*通讯作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

Hippo信号通路在哺乳动物器官发育大小的调节及细胞的增殖和凋亡过程中起着重要的作用[1]。YAP(Yes-associated protein)是一种转录共激活因子,是Hippo信号通路下游的主要效应成分[2]。Hippo信号通路的工作方式是由核心的激酶级联反应完成,上游的Mst磷酸化并激活Lats,活化的Lats磷酸化YAP蛋白,使其降解,Hippo信号通路处于激活;当上游分子Mst及Lats失活时,使得YAP蛋白的降解受到抑制从而抑制了Hippo信号通路[3,4]。近年来对Hippo信号通路在肿瘤发生发展中作用的研究表明,其在肺癌、结肠癌、乳腺癌及前列腺癌等中发挥着重要作用[5,6]。Hippo信号通路控制哺乳动物肝细胞的增殖,肝脏大小的调节以及肝癌的发生[7,8]。通过敲除上游分子Mst1抑制通路的激活使得YAP蛋白表达上调显著增加了肝癌细胞的增殖能力,同时发现S6K磷酸化水平增加[9],然而Hippo信号通路效应分子YAP通过何种途径促进肝癌细胞的增殖能力,成瘤能力及其与PI3K/mTOR之间是否存在通路间的相互调节作用目前仍不清楚。

本研究通过在肝癌细胞中过表达Hippo信号通路的效应分子YAP,研究其与mTOR信号通路之间的关系,阐述其增加肝癌细胞增殖能力和成瘤能力的机制,为靶向Hippo信号通路及寻找肝癌治疗靶点提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

细胞培养液RPMI1640购自Gibco BRL公司;氨卞青霉素钠、硫酸链霉素、雷帕霉素(Rapamycin)和G418试剂购自美国Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Hyclone公司;鼠抗人YAP、mTOR、兔抗人PTEN和AKT及P-AKT多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司;β-actin单克隆抗体从Santa Cruz公司购买;二抗为辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)连接的羊抗鼠、羊抗兔二抗购自Sigma公司;24孔板,96孔板及细胞培养皿购自Costar公司;ECL发光试剂盒购自Millipore公司,X感光胶片、定影液和显影液均购自碧云天生物技术研究所;人类YAP基因干扰载体(pGPU6/YAP/Neo和pGPU6/GFP/Neo)购自上海吉玛制药技术有限公司,pcDNA3.1载体由本院实验中心提供。

1.2 细胞培养

人肝癌BEL7402和HepG2购自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA),用含10%胎牛血清,1 000 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的RPMI1640细胞培养液,于37 ℃、5%CO2的条件下培养细胞,待单层细胞生长达到80%融合时,用胰蛋白酶消化细胞,收集细胞备用。

1.3 载体构建及细胞转染

利用YAP过表达和干扰载体,在肝癌细胞系中过表达和干扰YAP,检测YAP表达改变后肝癌细胞体外增殖及裸鼠体内成瘤能力的改变。人类YAP的基因序列(GenBank登陆号:NM-001130145.2)从人肝母细胞瘤HepG2细胞中扩增,PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min,98 ℃变性10 s,53 ℃退火10 s,72 ℃延伸2 min,30个循环,72 ℃10 min。扩增产物用EcoRⅠ和XbaⅠ进行酶切,通过基因重组将YAP基因链接于pcDNA3.1质粒CMV启动子之后并测序鉴定。

收集对数生长期的肝癌细胞,PBS冲洗2次,胰酶消化后计数,将5×105的细胞接种于6孔板中培养24 h。细胞实验分组:转染试剂对照组(Mock组)、空载体组(pcDNA3.1组和siRNA-control)、转染组(pcDNA3.1-YAP和siRNA-YAP)。根据脂质体转染说明书,将5 μl转染试剂Lipofectmine2000与2 μg载体或者空载体混合,室温放置20 min后,缓慢加入培养上清液中,摇晃混匀后继续培养,24 h后以1:10的比例将每组细胞传代,用G418药物筛选挑取单克隆后,通过Western blot鉴定其表达。

1.4 Western blot检测YAP及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白

提取细胞总蛋白,经过电泳、转移后加100 ml/L脱脂奶粉封闭60 min,加入抗YAP、PTEN、PI3K P85,AKT(S473)、AKT、mTOR(S2468)、mTOR抗体(1 ∶200稀释),4 ℃过夜,加入对应的HRP-IgG二抗(1 ∶5 000稀释)室温孵育1 h,采用化学发光试剂曝光显影,胶片扫描。

1.5 免疫共沉淀检测YAP与PTEN的结合

提取细胞蛋白质并定量,分成4份,一份做Input,其余的3份分别用抗YAP单克隆抗体、抗PTEN多克隆抗体和兔免疫血清(IgG)沉淀相应的抗原,然后用protein A/G-agarose把抗原抗体复合物吸附,离心并清洗,经高温变性使agarose珠子与蛋白质复合物分离,经SDS-PAGE变性胶分离,通过Western blot检测相关抗原的表达。

1.6 细胞计数和细胞活力检测(MTT)

细胞以5×104浓度接种于6孔板中,利用细胞计数器检测1周内细胞数并绘制细胞生长曲线,比较过表达/干扰YAP组和相应对照组中细胞增殖能力的差异。将1 000个细胞接种于96孔板中,连续7 d采用MTT法检测细胞活力。细胞经0.4%台盼蓝染液染色4-6 h,加入DMSO溶解在分光光度计570 nm测定吸光度并绘制曲线图。

1.7 异种移植瘤实验

选取对数生长期的过表达/干扰YAP组和相应对照组细胞经胰酶消化成单细胞悬液,台盼蓝染色法观察活细胞>95%,调整浓度使瘤细胞的终浓度为1×106/ml,将100 μl(1×105)细胞悬液接种于4-6周龄的BALB/c-nu裸鼠(购自上海斯莱克公司)双侧背部皮下,观察成瘤情况。

1.8 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件,计量资料以均数±标准差表示,采用独立样本t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hippo信号通路的失活对肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力的影响

在肝癌细胞系BEL7402和HepG2中稳定过表达YAP蛋白抑制Hippo信号通路,Western blot结果验证两个肝癌细胞系中的过表达YAP的细胞克隆(见图1A)。为了探讨YAP蛋白的过表达对肝癌细胞增殖能力和成瘤能力的影响,我们采用细胞计数和MTT实验检测肝癌细胞增殖能力的改变,采用裸鼠移植瘤实验检测肝癌细胞体内成瘤能力的改变,结果显示过表达YAP蛋白的肝癌细胞BEL7402-YAP和HepG2-YAP体外增殖能力均较对照组增强,并且差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。以105数量级的BEL7402-YAP/HepG2-YAP和BEL7402-pcDNA3.1/HepG2-pcDNA3.1分别接种于裸鼠皮下,经过8周的生长统计成瘤情况并绘制成瘤曲线,结果显示两个YAP蛋白过表达的细胞裸鼠成瘤能力明显增加,肿瘤生长曲线及肿瘤大小差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。以上结果表明Hippo信号通路的抑制促进了肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力。

图1 BEL7402和HepG2细胞系中YAP蛋白的过表达能够促进肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力Figure 1 The overexpression of YAP protein in BEL7402 and HepG2 increased the hepatocellular carcinoma cell growth and tumor formation

2.2 Hippo信号通路的激活能够抑制肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力

在HepG2干扰YAP的稳定转染克隆中进一步检测Hippo信号通路对肝癌细胞增殖能力的影响。细胞计数和MTT实验结果显示干扰YAP蛋白后,肝癌细胞HepG2的增殖能力较YAP干扰前降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。裸鼠成瘤生长曲线和移植瘤大小也较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。

图2 干扰YAP蛋白的表达能够抑制肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力Figure 2 The silencing of YAP protein inhibited the hepatocellular carcinoma cell growth and tumor formation

2.3 YAP蛋白介导PTEN调节PI3K/AKT/mTOR信号通路

PTEN作为经典的抑癌基因在YAP过表达细胞中表达下调,而在YAP干扰的肝癌细胞中表达上调(见图3A)。我们进一步探索了Hippo信号通路可能作用的其他信号通路,结果显示Hippo信号通路失活的细胞中即YAP过表达时,PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达上调,Hippo信号通路激活的肝癌细胞,PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达下调(见图3B)。为了进一步证实PTEN是否介导了这两个通路之间的调节关系,我们在Hippo信号通路抑制即过表达YAP蛋白的肝癌细胞中过表达PTEN,结果显示PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白下调,该通路被显著抑制;加入PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂雷帕霉素结果也显示PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制(见图3C)。另外,我们在YAP蛋白过表达的肝癌细胞中过表达PTEN或者加入雷帕霉素均使得肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05,见图3D)。以上结果表明YAP蛋白调节PTEN的表达介导了Hippo信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路之前的相互作用从而影响肝癌细胞的增殖能力。

图3 YAP蛋白介导PTEN调节PI3K/AKT/mTOR信号通路Figure 3 YAP protein regulated PI3K/AKT/mTOR pathway via PTEN

2.4 YAP蛋白结合PTEN蛋白抑制其活性

YAP蛋白是通过何种途径介导PTEN来调节PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而影响肝癌细胞的增殖能力的,我们通过在肝癌细胞中过表达带有His标签的YAP和HA标签的PTEN蛋白,结合免疫共沉淀实验,发现用His抗体作为诱饵蛋白沉淀产物中能够检测到PTEN蛋白的表达,反之当用HA作为诱饵蛋白时,通过免疫沉淀后western blot检测到了YAP蛋白的表达(见图4),表明YAP蛋白和PTEN蛋白在肝癌细胞中存在结合。

图4 过表达His-YAP和HA-PTEN的HepG2细胞中YAP蛋白与PTEN蛋白的结合Figure 4 The binding of PTEN and YAP in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 with His-YAP and HA-PTEN overexpression

3 讨论

Hippo信号通路是近年来新发现的一个信号转导通路,参与调控器官大小的发育,干细胞自我更新及组织再生[10,11],与癌症的发生密切相关[6]。YAP是Hippo信号通路下游的效应因子,从果蝇到哺乳动物高度保守。正常情况下Hippo信号激活时,YAP被降解。当Hippo信号失活时,YAP能够进入细胞核,与核内的转录因子相互结合,启动下游靶基因的转录,促进器官生长和肿瘤的发生,然而目前对于这一调控的分子机制还不是很清楚[12]。本研究中,我们利用过表达或者干扰YAP蛋白的方式抑制或者激活Hippo信号同理进而研究其在肝癌细胞增殖和异种移植瘤中发挥的作用及分子机制。

Hippo信号通路在肿瘤的研究中,Auer[13]首次报道了在淋巴瘤中Hippo信号通路的异常调节,指出Hippo信号通路被作为一条新的有潜在参与发病机制的通路。果蝇或小鼠中Hippo信号通路中的抑癌基因失活或癌基因YAP的活化导致组织过度生长,特征性的表现为细胞分化增加而凋亡受抑制[14]。YAP转基因小鼠的肝脏出现惊人的生长,并最终导致肝肿瘤的生长[15,16]。YAP作为一种候选的癌基因,在多种类型的人类肿瘤中,其表达以及在细胞核的定位都明显增加[17]。本研究中通过肝癌细胞中过表达和干扰YAP对肝癌细胞增殖和成瘤能力的影响,证实了作为Hippo信号通路中关键分子,YAP蛋白能够促进肝癌细胞的增殖能力和成瘤能力,发挥癌基因的作用。

Hippo信号通路与人类癌症的发生密切相关,但是其与其他信号通路的相互作用机制以及YAP在体内对癌症发生的调节机制等方面还需要进一步的研究,以阐明其在肿瘤发生中的作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路对于器官大小的调节和干细胞的发育起着关键作用,在肿瘤中也发挥着重要的作用[1,18]。最近的研究表明在果蝇中,Hippo信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路之间存着相互调节作用[19-21]。在果蝇中,Hippo信号通路能够通过负性调节AKT的活性抑制增长[22]。然而,两条信号通路在肿瘤中的相互作用及其分子机制仍不清楚。本研究中,我们发现YAP过表达的肝癌细胞激活了细胞生长的重要调控因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路。PTEN作为PI3K/AKT/mTOR的负调控因子,可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。在肝癌细胞中,YAP与PTEN具有相互作用并可以抑制PTEN转录,下调PTEN蛋白的表达,而PI3K/AKT/mTOR信号途径的负调控机制受到抑制,PI3K/AKT/mTOR信号途径激活。因此肝癌细胞中YAP过表达激活了mTOR信号通路。我们还证实YAP通过调控PI3K/AKT/mTOR信号控制肝癌细胞的生长和肿瘤形成。

综上,本研究揭示了Hippo信号通路与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的相互作用与功能相关性,阐述了YAP蛋白作为Hippo信号通路关键分子作为癌基因参与肝癌细胞增殖的调控机制,为肝癌病因、诊断和治疗的研究提供了新的分子基础。