肺移植术后稳定状态受者T淋巴细胞亚群的动态变化分析

练巧燕 陈奥 徐鑫 韦兵 蔡宇航 黄丹霞 何建行 巨春蓉

肺移植是治疗终末期肺病的唯一有效手段。T淋巴细胞是介导排斥反应的主要效应细胞[1]，为预防排斥反应，肺移植受者需终生服用针对T淋巴细胞的免疫抑制剂。但同时T淋巴细胞是抵御外界病原菌的“卫士”[2]，过度抑制会导致感染的风险增加[3]。正常机体内，外周血CD3+CD4+T淋巴细胞与CD3+CD8+T淋巴细胞保持动态平衡，维持机体正常的细胞免疫功能。已有大量关于肝、肾移植术后T淋巴细胞亚群变化的研究报道，而关于肺移植术后受者T淋巴细胞亚群的数量及其动态变化的研究较少。本研究选取术后稳定状态（存活1年以上且术后1年内未因急性排斥反应及感染再次住院）的41例受者，分析其术后1年内T淋巴细胞亚群的变化情况及影响因素，以了解肺移植受者的免疫状态，为及时调整治疗方案提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料及入组标准

广州医科大学附属第一医院移植中心自2016年1月至2019年3月共完成152例肺移植手术，根据纳入和排除标准，选取41例术后稳定状态的受者为研究对象（图1）。其中男31例，女10例，年龄28～69岁。单肺移植34例，双肺移植7例。原发病分别为阻塞性肺疾病13例，限制性肺疾病26例，感染性肺疾病2例。根据国际心肺移植协会（International Society for Heart and Lung Transplantation，ISHLT）标准[4]，其中16例在术后72 h发生原发性移植物功能障碍（primary graft dysfunction，PGD）。

纳入标准：（1）年龄>18岁；（2）供、受者ABO血型相同；（3）受者术前群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）阴性；（4）存活1年以上且术后1年内未因排斥反应或感染再次住院。

排除标准：（1）受者术前PRA阳性者；（2）多器官联合移植或再次移植者；（3）骨髓或干细胞移植术后者；（4）因排斥反应或感染再次住院者；（5）术后出现人类免疫缺陷病毒（human immunode ficiency virus，HIV）感染或活动性肝炎、肿瘤者；（6）术后出现移植后淋巴组织增生性疾病（posttransplant lymphoproliferative disease，PTLD）者；（7）术后1年内死亡以及诊断不明确、临床资料不全者；（8）依从性差，不愿意配合检查者。

图1 41例肺移植受者入选流程Figure 1 The inclusion process of 41 lung transplant recipients

1.2 免疫抑制方案

单肺移植受者术中按体质量予甲泼尼龙10 mg/kg静脉滴注，双肺移植受者术中予甲泼尼龙15 mg/kg静脉滴注。所有肺移植受者均使用他克莫司或环孢素+吗替麦考酚酯+泼尼松经典三联免疫抑制方案。

1.3 检测方法

分别在手术前、术后2周及每个月（术后1年内），采集肺移植受者清晨空腹静脉血2 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝。检测步骤如下：（1）取EDTA抗凝外周血100 µL加入流式细胞仪专用试管；（2）根据需要检测的T淋巴细胞不同亚群，加入相应的标记抗体各10 µL混匀，室温避光孵育15 min；（3）加入红细胞裂解液500 µL混匀，室温避光放置10 min，待红细胞裂解完全；（4）加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）500 µL 混匀，室温避光平衡 5 min；（5）加入100 µL绝对计数微球，振荡混匀；（6）将上述处理好的样本加入FC500流式细胞仪进行检测。应用FLOWJO软件分析，在前散射和侧散射的二维Dot-plot图上，根据细胞内颗粒的密度及大小，选择淋巴细胞区，按荧光强度自动测算选定区结合某单克隆抗体的阳性细胞比例和绝对值，并计算CD4+/CD8+比值。

1.4 研究内容

分析肺移植受者术前及术后1年内T淋巴细胞亚群绝对值及CD4+/CD8+比值的动态变化。通过阅读文献及临床经验，分析受者年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、手术方式、PGD发生情况及原发病对T淋巴细胞绝对值的影响。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析及GraphPad Prism作图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，不符合正态分布则以中位数（四分位间距）表示。重复测量的纵向资料采用广义估计方程进行分析，并以术后12个月为参考与其他时间点进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺移植受者术前及术后1年内T淋巴细胞亚群绝对值及比值的变化趋势

图2 肺移植受者外周血T淋巴细胞亚群的检测结果Figure 2 Detection results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of lung transplant recipients

图3 肺移植受者术前及术后1年内T淋巴细胞亚群的动态变化Figure 3 Dynamic changes of T lymphocyte subsets in lung transplant recipients preoperative and within 1 year after operation

流式细胞术检测肺移植术后稳定状态受者T淋巴细胞亚群的结果如图2。受者术前及术后1年内CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值及CD4+/CD8+比值的动态变化见图3。结果显示，受者术后1年内，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值及CD4+/CD8+比值随时间变化差异有统计学意义（均为P<0.001）。CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞绝对值在术后6个月内短暂下降后逐渐上升，6～12个月随时间变化差异无统计学意义（均为P>0.05）；CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值在术后5个月内逐渐上升，5～12个月随时间变化差异无统计学意义（P>0.05）。CD4+/CD8+比值在术后4个月内短暂上升后逐渐下降，4～12个月随时间变化的差异无统计学意义（P>0.05）。与术前相比，术后12个月CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞绝对值差异均无统计学意义（P=0.659、0.109），CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值升高（P=0.02），而CD4+/CD8+比值下降，差异有统计学意义（P<0.001）。

2.2 肺移植受者T淋巴细胞亚群绝对值动态变化的影响因素分析

采用广义估计方程对41例肺移植术后稳定状态受者CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值变化的影响因素进行分析（表1）。结果显示，受者的年龄、性别、BMI、手术方式以及术后是否发生PGD对CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值的动态变化无影响（均为P>0.05）。术前原发病对CD3+CD4+T淋巴细胞绝对值的变化无影响，但感染性肺疾病受者术后CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值较高（P<0.05）。

表1 T淋巴细胞亚群绝对值变化的影响因素分析Table 1 Influence factors analysis of the change of absolute value of T lymphocyte subsets

3 讨 论

最早在1981年，美国科学家Cosimi等[5]发现CD4+/CD8+比值升高与肾移植术后排斥反应密切相关。目前研究已证实CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞在同种异体器官移植术后介导排斥反应、抵御病原菌、诱导免疫耐受等方面发挥重要作用[6-7]。在心、肝、肾移植领域，国内外已有大量关于T淋巴细胞亚群的研究，普遍认为外周血T淋巴细胞亚群可以反映受者的免疫状态[8-12]。免疫抑制失衡导致的急性排斥反应与感染是肺移植术后1年内最主要的并发症，可直接导致受者死亡，也是远期并发慢性PGD的独立危险因素[13-15]。过度免疫抑制还可引起肿瘤免疫监控功能受损，导致肺移植受者恶性肿瘤的发生率增加[16-18]。ISHLT的数据显示，肺移植受者术后1年生存率约为80%，平均中位生存期为6.7年，而生存期超过1年的受者中位生存期可达8.9年[19]。因此，准确把握肺移植受者术后1年内的免疫抑制水平，不仅可降低急性排斥反应和感染的风险，还能提高肺移植受者的长期生存率。

Coiffard等[20]发现肺移植受者术后3～30 d外周血淋巴细胞总数、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞均呈下降趋势，之后逐渐上升并在200 d到达平台期。本研究回顾性分析了41例肺移植术后稳定状态受者1年内外周血T淋巴细胞亚群的动态变化，发现CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值在肺移植术后早期（2周）下降，6个月内随时间逐渐恢复，6～12个月变化差异不大，与国外的研究结果基本一致[4,20-21]。由此可见，肺移植受者术后的免疫抑制程度并不是一成不变的，而是随着免疫抑制方案的调整和时间的推移，逐渐达到免疫稳态。

本研究发现，肺移植受者术后1年内CD3+CD4+T淋巴细胞绝对值均低于术前，而CD3+CD8+T淋巴细胞绝对值在术后早期下降，随之逐渐增加，术后12个月高于术前，导致CD4+/CD8+比值倒置。当外周血CD3+CD4+T淋巴细胞绝对值<200/μL时，感染率明显升高，特别是特殊病原菌感染[4,22]。结合本研究结果，建议在肺移植术后早期，当CD3+CD4+T淋巴细胞绝对值<200/μL时适当降低免疫抑制强度。已有研究表明，肺移植受者外周血和小气道内CD3+CD8+T淋巴细胞的增多与肺移植术后闭塞性细支气管炎综合征的发生密切相关[18,23-25]。本研究中，肺移植受者术后外周血CD3+CD8+T淋巴细胞的升高是否与远期（术后1年后）慢性PGD的发生相关，有待继续跟踪随访和进一步研究。

以往研究认为免疫诱导治疗、年龄、体质量、术前T淋巴细胞水平均可影响肺移植术后T淋巴细胞亚群的数量，年龄越大、体质量越低，肺移植术后外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞下降越明显[18,26]。本研究结果显示，术后T淋巴细胞亚群的动态变化与受者年龄、BMI、手术方式以及术后是否出现PGD无关，可能与本研究样本量较小，以及本移植中心经验性根据患者肺移植术前的状态、年龄及免疫状态调整了免疫抑制剂的用量相关。

综上所述，肺脏是一个容易发生排斥反应和感染的器官[27-30]，把握免疫抑制的平衡点至关重要。动态监测外周血T淋巴细胞亚群的变化，有助于临床医师了解肺移植受者的免疫状态，建议术后早期（1年内）进行常规监测。对于T淋巴细胞亚群绝对值及比值是否可作为肺移植受者调整免疫抑制剂的参考指标，有待后续进一步研究。