多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道

张玄 王琳 张洪涛 杨诏旭 岳树强 杨雁灵 董海龙 陈敏 路志红 程亮 刘金成 俞世强 张更 秦卫军 李纪鹏 魏红江 杨璐菡 周亮 龙恩武 陶开山 窦科峰

目前，随着器官移植技术的日益成熟，供体短缺已成为严峻的全球性问题，严重阻碍着临床器官移植的发展[1-2]。以基因编辑猪为供体的异种移植是解决这一难题的有效途径之一[3]。近年来，供体猪的基因编辑过程实现了快速、高效和多样化[4]，其器官在非人灵长类动物体内的存活时间不断延长，原位肾脏移植受体术后最长存活时间达499 d[5]，异位和原位心脏移植受体术后最长存活时间分别为945 d和195 d[6-7]。与此同时，作为病原体跨物种感染核心的猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus, PERV）也在供体猪中被敲除，并实现了PERV敲除猪的培育繁殖[8-9]。临床异种器官移植发展初具规模[10-11]。

在供体猪的多样化基因编辑过程中，敲除引起超急性排斥反应的3种主要异种抗原基因[α-1，3-半乳糖基转移酶（α-1，3-galactosyltransferase，GalT）、β-1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2（β-1，4-N-acetylg alactosaminyltransferase 2，β4GalNT2）、单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）]，并转入抑制补体活化、调节凝血紊乱、抗炎抗吞噬的人源化基因等，是降低灵长类受体免疫反应、减少移植物损伤的重要手段[4]。在筛选适合临床应用的基因编辑组合时，出现了“7基因编辑”猪、“9基因编辑”猪等临床移植潜在的供体，但其实际应用效果仍有待通过临床前实验来验证[4,12-13]。

在前期基础上，本研究团队在国际范围内首次成功培育出基因改造程度最大的PERV敲除猪，实现了“13基因编辑”，即PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39（PERV-KO/3-KO/9-TG），并将其作为供体，实施了猪-恒河猴异种心脏、肝脏和肾脏移植的临床前研究，探索了此种类型供体猪在异种器官移植中的临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验动物

供体：PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAHKO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/ hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39（PERV-KO/3-KO/9-TG）的基因编辑Bama小型猪，体质量11.0 kg，血型O型，由杭州启函生物科技有限公司和云南农业大学动物医学院联合培育提供。受体：恒河猴，由四川省医学科学院暨四川省人民医院实验动物研究所提供。其中心脏移植受体（芯片号61890），雄性，体质量8.6 kg，血型B型；肝脏移植受体（芯片号61873），雄性，体质量14.7 kg，血型B型；肾脏移植受体（芯片号823804），雄性，体质量10.6 kg，血型B型。所有实验均通过空军军医大学实验动物伦理委员会审核。

1.2 手术方式

心脏移植采用腹部异位心脏移植，具体术式同小鼠腹部心脏移植[14]。肝脏移植采用脾窝异位辅助性肝脏移植[15-16]，因前期术式门静脉灌注量偏低，本研究对该术式进行了改良：在肾静脉平面下方离断受体下腔静脉，将移植肝脏门静脉和远心端下腔静脉吻合，肝静脉和近心端下腔静脉吻合，肝动脉和腹主动脉吻合，胆道行胆肠吻合。肾脏移植受体自体双肾切除后，采用临床常规的左髂窝肾脏移植[17]。

1.3 免疫抑制方案

心脏移植：抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）术前1 d给药（5 mg/kg）；眼镜蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）术前 1 d给药（100 μg/kg）； 抗 CD20单克隆抗体（anti-CD20 monoclonal antibody, aCD20）术前1周、手术当日和术后每周1次给药（19 mg/kg）；抗CD40单克隆抗体（anti-CD40 monoclonal antibody, aCD40）术前1 d给药（40 mg/kg），手术当日、术后4 d、术后9 d、之后每周1次给药（20 mg/kg）；吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）术后每日2次给药（20 mg/kg）；甲泼尼龙（methylprednisolone，MP）手术当日给药（10 mg/kg），术后1 d减半，之后每3 d减半。

肝脏移植：ATG术前1 d给药（5 mg/kg）；CVF术前1 d给药（100 μg/kg）；他克莫司（tacrolimus，Tac）每日2次（0.06 mg/kg）；aCD40手术当日、术后4 d给药（20 mg/kg），术后7 d、之后每周1次给药（10 mg/kg）；MP手术当日给药（10 mg/kg），术后1 d减半，之后每3 d减半。

肾脏移植：ATG术前1 d给药（5 mg/kg）；aCD20术前1周、手术当日、术后每周1次给药（19 mg/kg）；aCD40术前1 d给药（40 mg/kg），手术当日、术后4 d、术后7 d、之后每周1次给药（20 mg/kg）；Tac每日2次给药（0.06 mg/kg）；MMF术后每日2次给药（15 mg/kg）；MP手术当日给药（10 mg/kg），术后1 d减半，之后每3 d减半。

1.4 研究内容

观察血流重建后各移植物的功能状态，包括颜色、质地、血流灌注及器官功能恢复情况，并总结受体存活情况；采用彩色多普勒超声（彩超）监测移植物的血流动力学情况；比较各器官移植受体的心肌酶谱、肝功能和肾功能等血液学指标变化；在观察终点，获取各移植物组织样本，行组织病理学检查。综合评估移植器官功能状态和异种移植排斥反应发生情况。

2 结 果

2.1 血流重建后各移植物的功能状态和受体存活情况

手术过程顺利，各移植物血流恢复后均显示颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好（图1）。其中，移植心脏即刻复跳，搏动规律有力；移植肝脏有金黄色的胆汁从胆管流出；移植肾脏可见尿液从输尿管中流出。心脏、肝脏和肾脏移植受体的存活时间分别为7 d、26 d和1 d，分别死于下腔静脉血栓形成、凝血紊乱所致低血压和严重心律失常。

2.2 移植物的血流动力学情况

采用彩超对各移植物分别进行血流动力学监测。结果显示，术后1 d，移植心脏、肝脏和肾脏均表现为动、静脉血流状态充盈、灌注情况良好（图2）。

2.3 血液学指标的变化

图1 血流重建后各移植物的功能状态Figure 1 The functional states of xenografts after blood flow reconstruction

采集各受体术后不同时间点的血液样本，进行心肌酶谱、肝功能和肾功能检测。结果显示，心脏移植受体术后1 d肌酸激酶、肌酸激酶同工酶以及乳酸脱氢酶水平均升高，分别为3 720 U/L、513 U/L和1 744 U/L，至术后6 d逐渐恢复至接近正常水平。术后7 d，各项指标均急剧升高，分别为51 852 U/L、956 U/L和5 766 U/L（图3A）。肝脏移植受体术后2 d天冬氨酸转氨酶水平升高，达到3 714 U/L，丙氨酸转氨酶为365 U/L，总胆红素为13 μmol/L。术后10 d转氨酶基本恢复正常水平，但总胆红素持续升高。术后12 d，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平均出现升高，至术后15 d达到高峰，分别为1 398 U/L和151 U/L，总胆红素为74 μmol/L（图3B）。结合受体临床表现，考虑移植肝脏出现异种排斥反应，给予糖皮质激素治疗后各项指标逐渐好转。肾脏移植受体术后1 d血清肌酐374 μmol/L，并出现轻微蛋白尿，后因突发严重心律失常死亡。

2.4 移植物组织病理学表现

分别在各移植终点获取移植物组织样本，行苏木素-伊红染色。结果显示，在移植终点，移植心脏和肾脏组织结构接近正常（图4A、D），而移植肝脏表现为片状坏死（图4B、C分别显示不同的区域），肝组织结构出现紊乱，并伴有明显炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病。

3 讨 论

目前，异种器官移植主要存在超急性排斥反应、急性排斥反应、凝血功能障碍和物种间交叉感染等问题[4]。将异种器官移植应用于临床，一方面需要对供体猪进行大规模的基因改造，提高其人源化程度，以减轻异种移植免疫排斥反应、克服凝血功能紊乱等[12,18]；另一方面则需要摸索合适的免疫抑制方案，并通过大量动物实验来观察移植物功能和受体存活状态，从而验证基因编辑效果[4]。本研究中的供体，在世界范围内首次实现了PERV敲除联合3种主要异种抗原基因敲除（GalT、β4GalNT2、CMAH），以及抑制补体活化（hCD46、hCD55、hCD59）、调节凝血紊乱（hTHBD、hTFPI、hCD39）、抗炎抗吞噬（hB2M、hHLA-E、hCD47）的9种人源化基因转入[9]，在世界范围内，属于基因改造程度最大、人源化程度最高的供体猪类型。理论上，该类供体既可解决异种器官移植后PERV交叉感染及超急性排斥反应的问题，也可以降低异种器官移植术后急性排斥反应和凝血功能紊乱等问题。同时，移植受体选择恒河猴，相比于其它非人灵长类具有以下优势：（1）恒河猴基因组与人类基因组的同源性达94%，生理指标与人类接近[19]；（2）恒河猴基因组测序工作已完成[20]，且高质量的中国恒河猴参考基因组为功能注释提供了关键数据[21]；（3）实验中所使用的aCD40免疫抑制剂在恒河猴体内的效能明确[5,22]。

图2 术后1 d各移植物的血流动力学情况Figure 2 Hemodynamic condition of xenografts at 1 d after operation

图3 心脏移植和肝脏移植受体心肌酶谱和肝功能的变化Figure 3 Changes of myocardial enzyme spectrum and liver function of heart transplant and liver transplant recipients

图4 各移植物组织病理学表现（苏木素-伊红，×200）Figure 4 Histopathological manifestations of xenografts

本研究在国际范围内首次使用PERV敲除的“13基因编辑”猪作为供体[4]，并同时将1只供体的器官分别移植给3只受体，结果发现移植物再灌注后颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好，提示GalT、β4GalNT2、CMAH敲除可抑制异种移植超急性排斥反应，与其他学者前期的研究结果一致[13,23]。但是，随着受体生存期延长，移植肝脏出现明显的体液性排斥反应，表现为片状坏死，肝组织结构出现紊乱，并伴有炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病等，提示供体猪9种人源化基因的转入并不能完全避免异种移植物损伤。本研究中，肝脏移植受体突破了猪-猴辅助性肝脏移植国际同类术式最长存活时间记录[4,24]，在一定程度上证实了PERV-KO/3-KO/9-TG猪在改善移植排斥反应、受体凝血异常等方面仍有自身优势，但其能否作为临床异种器官移植的潜在供体仍需进一步评估。此外，PERV敲除理论上可阻断病毒跨物种传播，本研究结果也提示PERV不会传播到受体血液或组织中，但PERV监测仍然是一个值得关注的问题，尤其是在长期存活的受体当中[25]。

综上所述，PERV-KO/3-KO/9-TG猪在克服超急性排斥反应、缓解体液性排斥反应及凝血紊乱方面具有一定优势，但其能否作为临床异种器官移植潜在供体需进一步评估。异种器官移植临床前研究实施难度大，受体依从性差，给药窗口窄，用药、护理等术后管理困难[12,15]。本研究在前期研究的基础上[15]，采用同一基因编辑猪作为3种器官供体，并同时完成心脏、肝脏和肾脏移植，为后期进一步的临床研究积累了丰富经验，并提供了重要的数据支撑。