利用原子力显微镜对大肠癌药物筛选的研究

武传佳，高菁菁，武 杰，陈旭东，孙佰顺

（1.吉林市中心医院，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院，吉林 吉林 132013；3.长春理工大学（国家纳米操纵与制造国际联合研究中心），吉林 长春 130022）

消化系统的癌症是临床上癌症发病率较高的一种癌症，大肠癌患者在消化系统癌症患者的比例较高，尤其是70岁以上人群高发癌症一种[1]。大肠癌症患者经过积极手术和化疗治疗还是有较高的生存率的[2]。化疗药物的用量和筛选是癌症患者治疗效果的关键因素。但由于患者自身对化疗药物耐药性各有不同，如何对每一个患者进行精准用药是临床上面临的一个很大的挑战[3]。

上个世纪八十年代初，第一台AFM研制成功，使人们可以实现对液相的样品进行三维形貌成像[4]。由于AFM能够许多医学样本材料进行扫描成像[5]，为医学研究开辟了一条新的研究方向，使得AFM很快成为了医学领域科学研究的一种有效工具[6-7]。例如，AFM可以在液相下，对活体细胞进行扫描成像[8]，这可以测量活体细胞的很多物理学特性[9-10]，为医学研究提供新的途径，已经逐渐成为医学研究中一种重要的研究工具[11]。本文利用原子力显微镜（AFM）对普通的大肠癌细胞HT-29和经过抗癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药处理的大肠癌细胞株HCT-8/5-FU加入抗癌药物5-FU后0h、3h、6h进行扫描成像。对AFM扫描的图像的粗糙度进行对比，以便找到普通的大肠癌细胞HT-29和经过抗癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药处理的大肠癌细胞株HCT-8/5-FU加入抗癌药物5-FU后0 h、3 h、6 h的差别。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

将大肠癌细胞HT-29和HCT-8分别用10%的胎牛血清（FBS，Hy Clone）的RPMI-1640培养液（Hy Clone）进行培养，培养箱环境设置为温度为37°、CO2含量为5%。每天更换一次培养液，在HCT-8细胞培养至细胞铺满基底大约80%时，加入500 ng/ml的5-FU，24 h后大约70%左右的细胞死亡，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻冲洗死亡的细胞和5-FU残留药物。再用10%的胎牛血清（FBS，Hy Clone）的RPMI-1640培养液（Hy Clone）重新培养到铺满基底大约80%时，再次以梯度为500ng/ml的方式增加药物浓度，连续培养直至5-FU的浓度为15ug/ml且细胞能够稳定生长，该细胞即为耐药细胞HCT-8/5-FU。

1.2 扫描成像

取6孔培养板先加入经过高温蒸汽消毒的盖玻片，每孔1片，与培养皿底部贴牢固定，再加入细胞数为1×105/ml的HT-29和HCT-8/5-FU的细胞悬液，培养12h后，采用AFM（JPK NanoWizard@ 3 BioScience）使用探针ContAl-G（Budget Sensors）对培养的细胞进行接触式扫描成像。

2 实验结果

利用AFM对加入5-FU后HT-29和HCT-8/5-FU的0 h、3 h、6 h进行扫描成像。HT-29细胞加药作用后，细胞高度曲线变得不平整，HCT-8/5-FU细胞加药作用后，细胞表面还是比较平滑，褶皱比较少。

3 图像数据分析

对AFM扫描的HT-29细胞的图像进行分析，获得大肠癌细胞HT-29加药0 h、3 h、6 h时的一些数据，如表1所示，细胞高度分别为5.56±0.65 um、6.47±0.35 um、4.53±0.89 um长度为35.57±3.45 um、24.53±2.55 um、20.23±2.37 um，宽度为27.53±2.75 um、23.51±2.63 um、19.54±1.63 um，粗糙度分别为94.57±18.62 um、156.39±39.54 um、205.37±14.53 um。从以上数据可以看出随着药物作用时间增加，HT-29细胞的高度、长度、宽度、粗糙度都发生了变化，但粗糙度变化的趋势明显。

表1 5-FU作用HT-29细胞不同时间后细胞高度、长度、宽度和粗糙度变化

对AFM扫描的HCT-8/5-FU细胞的图像进行分析，获得大肠癌细胞HCT-8/5-FU加药0h、3h、6h时的一些数据，如表2所示，细胞高度分别为5.31±0.45 um、4.84±0.67 um、4.95±0.63 um长度为35.63±3.24 um、33.46±3.82 um、34.67±5.63 um，宽度为26.83±3.48 um、23.53±2.35 um、22.56±2.15 um，粗糙度分别为139.47±25.41 um、138.46±23.43 um、142.13±31.45 um。从以上数据可以看出随着药物作用时间增加，HCT-8/5-FU细胞的高度、长度、宽度、粗糙度都发生了变化，但变化的趋势不明显，可作为药物评价的一个重要指标。

经AFM扫描图像的数据分析大肠癌细胞HT-29在5-FU作用后的高度、长度、宽度、粗糙度四个客观数值比较，粗糙度具有统计学意义（P＜0.05）。耐药细胞HCT-8/5-FU在5-FU作用后的高度、长度、宽度、粗糙度四个客观数值比较均无统计学意义（P＞0.05）。HT-29和HCT-8/5-FU细胞在用药0h、3h、6h，只有HT-29加药后的粗糙度具有统计学意义（P＜0. 05）。上述结果表明细胞粗糙度可作为HT-29和耐药株HCT-8/5-FU的耐药性筛查的统计学的一项指标。

4 结 论

利用AFM对加药后不同时间段的大肠癌细胞HT-29和经过5-FU耐药处理的HCT-8/5-FU的细胞进行扫描成像。通过对AFM扫描的图像进行数据分析得出细胞的高度、长度、宽度、粗糙度的四个客观数据，并对以上四个客观数据进行统计学分析得出大肠癌细胞HT-29在加药后0 h、3 h、6 h的细胞的粗糙度具有较好的统计学意义（P＜0. 05）。利用AFM扫描成像的细胞粗糙度可作为大肠癌药物耐药性筛查的一项指标，对于临床上抗癌药物的耐药性研究具有一定参考价值。