UPLC法测定不同产地山茱萸中6种成分含量

2021-01-15苏鹏超蔺蓓蓓

陕西理工大学学报(自然科学版) 2020年6期

苏鹏超，蔺蓓蓓，陈琛,2*

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000; 2.陕西理工大学中德天然产物研究所/陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心，陕西汉中 723000)

中药山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc)为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸干燥成熟果肉，始载于《神农本草经》，为我国传统珍贵的中药材，又名山萸肉、石枣、蜀枣、枣皮等[1]。山茱萸主要分布于河南、陕西、浙江、安徽、山西等省份，对环境的适应能力较强[2]。山茱萸含有糖苷类及苷元、鞣质类、有机酸及其酯类、挥发油、五环三萜及其酯类、环烯醚萜苷、微量元素等，富含不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值，是很好的亚油酸来源[3-7]。其中，环烯醚萜苷类成分具有消炎、防衰老、抗氧化、降血糖、调节免疫活性、抗癌等作用[8-11]，主要活性成分包括莫诺苷、当药苷、马钱苷、山茱萸新苷等十余种。此外，五环三萜类成分具有降血糖、调血脂作用[12-15]，具有保肝、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化应激等功效，主要活性成分有齐墩果酸和熊果酸[16-19]。

关于山茱萸含量的测定已取得了一些成果，如唐凯等[20]测定了山茱萸果核中4种成分的含量，刘云[21]对山茱萸炮制前后4种成分的含量变化作了对比等。目前，山茱萸的质量评价与控制标准仍然不够全面，本研究建立了同时测定莫诺苷、当药苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸和熊果酸6种成分的分离分析方法，实现对山茱萸药材中多种成分含量的同步测定，为使山茱萸药材的质量评价更全面、合理。

1 材料与仪器

1.1 药材

山茱萸果实分别采自河南省西峡县、浙江省淳安县、陕西省佛坪县，经陕西理工大学生物科学与工程学院王勇博士鉴定，确定为山茱萸属山茱萸果实，洗净去核后烘干备用。

1.2 试剂

莫诺苷(批号25406-64-8)、当药苷(14215-86-2)、马钱苷(批号18524-94-2)、齐墩果酸(批号508-02-1)、熊果酸(批号77-52-1)购自上海诗丹德生物技术有限公司；山茱萸新苷(批号131189-57-6)购自上海同田生物技术股份有限公司；UPLC-DAD(面积归一化法)检测标准品纯度均大于98%；甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(Sigma公司)和体积分数85%磷酸(天津市大茂化学试剂厂)均为色谱纯，实验用水为超纯水。

1.3 仪器

Ultimate 3000超高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，ME104E /02型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，KQ5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，RE-3000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，UPH-11-20T超纯水机(ULUPURE公司)，岛津Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，4 μm)，中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液及混合对照品溶液的制备

精密称取对照品莫诺苷10.0 mg、当药苷10.0 mg、马钱苷11.9 mg、山茱萸新苷5.2 mg、齐墩果酸9.8 mg、熊果酸13.0 mg，用甲醇分别多次溶解定容至6个10 mL容量瓶中，得对应质量浓度分别为1.00、1.00、1.19、0.52、0.98、1.30 mg/mL的储备液。分别取上述对照品储备液适量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至10 mL。混合对照品溶液浓度分别为：莫诺苷0.050 mg/mL、当药苷0.050 mg/mL、马钱苷0.073 mg/mL、山茱萸新苷0.016 mg/mL、齐墩果酸0.039 mg/mL、熊果酸0.091 mg/mL。

2.2 供试品溶液的制备

取3种产地山茱萸果实适量，粉碎机粉碎，精密称定粉末(过80目筛)各4 g，置500 mL平底烧瓶中，以1∶10料液比加入体积分数90%乙醇，70 ℃下热回流提取90 min，重复提取两次，过滤合并两次滤液，减压浓缩至干，色谱级甲醇溶解定容至10 mL容量瓶得山茱萸乙醇提取物供试液。

精密称定3种产地山茱萸果实粉末(过80目筛)各4 g，置500 mL平底烧瓶中，以1∶10料液比加入去离子水，70 ℃下热回流提取120 min，重复提取两次，过滤合并两次滤液，减压浓缩至干，超纯水溶解定容至10 mL容量瓶得山茱萸水提取物供试液。

2.3 色谱条件

UPLC分析在Thermo UltiMate 3000 UPLC系统上进行，该系统由四元泵、自动进样器、柱温箱、样品盘和UV检测器组成。分析柱是岛津Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，4 μm)，流动相为乙腈(A)和0.2%磷酸(B)，检测波长为210、218、240 nm，进样量为10 μL，流速为1 mL/min，检测温度为30 ℃。梯度洗脱条件：0～10 min，10%～20%A；10～20 min，20%～40%A；20～35 min，40%～60%A；35～55 min，60%～80%A；55～60 min，80%A。每个样品平行3次。混合对照品色谱图见图1，佛坪山茱萸乙醇提取物色谱图见图2。

注：1-莫诺苷;2-当药苷;3-马钱苷;4-山茱萸新苷;5-齐墩果酸;6-熊果酸图1 混合对照品的UPLC色谱图(210 nm)

(a) 240 nm(1-莫诺苷，2-当药苷， 3-马钱苷)

(b) 218 nm(1-山茱萸新苷)

2.4 系统适用性

精密吸取2.1项下混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件测定，记录色谱图。莫诺苷、当药苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸、熊果酸6个化学成分的保留时间分别为6.043、8.467、8.943、15.727、54.537、55.487 min。混合对照品所测的6种成分与相邻色谱峰的分离度较好，系统适用性实验符合含量测定要求。

2.5 线性关系考察

按2.3项下色谱条件进行测定，调整2.1项下对照品储备液的进样量为3、6、9、12、15 μL(n=3)，以各对照品质量浓度x(μg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归，各成分回归方程和线性范围见表1。结果表明，6种成分在测定范围内线性关系良好。

表1 各被测成分的标准曲线、线性范围和相关系数

2.6 仪器精密度实验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.3项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得出莫诺苷、当药苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD(n=6)分别为0.08%、0.13%、0.24%、0.11%、0.15%、0.74%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性考察

取佛坪山茱萸果实粉末6份，每份4 g，按2.2项下方法制备乙醇提取液，按2.3项下色谱条件进样，记录峰面积，计算含量。莫诺苷、当药苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸、熊果酸含量(n=6)分别为5.22、3.83、0.73、1.03、0.58、0.25 mg/g，其RSD分别为0.50%、0.46%、1.26%、0.42%、0.78%、1.92%，表明重复性良好。

2.8 供试品溶液稳定性实验

取同一份供试品溶液(佛坪山茱萸果实乙醇提取物供试液)，在溶液配置后的0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算得出莫诺苷、当药苷、马钱苷、山茱萸新苷、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD(n=6)分别为0.73 %、0.42 %、1.34 %、0.36 %、0.71%、1.50%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 样品含量测定

分别取不同产地山茱萸果实，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3项下色谱条件进样，外标法计算样品含量,结果见表2。

表2 山茱萸果实中6种成分含量测定结果 mg/g(n=3)

P<0.05。

3 讨论与结论

3.1 样品提取方法的选择

水提、醇提为提取常用方法，且两种溶液极性差异大。本研究参考刘艳妮[4]、张永生[21]的实验，最终确定为1∶10的料液比，采用体积分数90%乙醇，70 ℃下热回流提取90 min制备山茱萸果实乙醇提取物；确定1∶10的料液比，采用去离子水，70 ℃下热回流提取120 min制备山茱萸果实水提取物的提取方法。

3.2 色谱条件的考察

参考刘艳妮[4]的研究，采用全波长进行扫描，确定了3个环烯醚萜苷类化合物的最大吸收波长为240 nm，另一个环烯醚萜苷类化合物山茱萸新苷的最大吸收波长为218 nm，两种五环三萜类化合物的最大吸收峰为210 nm。在流动相体系选择中，对比了甲醇-水、乙腈-体积分数0.1%磷酸水溶液、乙腈-体积分数0.2%磷酸水溶液体系，结果表明，只有用乙腈-体积分数0.2%磷酸水溶液系统时才能使3个环烯醚萜类成分分离完全，且基线平稳，因此采用该流动相对供试样品进行梯度洗脱。

3.3 含量测定结果分析

3个产地的山茱萸果实乙醇提取物均可检出6种成分，由于生长环境不同，其成分含量有所差异。6种成分含量由高到低排布序列为莫诺苷>当药苷>山茱萸新苷>马钱苷>齐墩果酸>熊果酸；3个产地的山茱萸果实水提取物均可检出4种成分，齐墩果酸与熊果酸未检测出，初步判定该两类成分不溶于水或者水提取率低，与前人研究相符[22]。产自陕西佛坪的山茱萸果实乙醇提取物中6种成分含量最均衡，河南西峡的山茱萸果实水提取物中莫诺苷含量最多，含量为(6.40±0.064) mg/g，浙江淳安的山茱萸果实乙醇提取物中马钱苷和齐墩果酸含量最多，含量分别为(0.89±0.030)、(0.62±0.010) mg/g。