山西老陈醋源植物乳杆菌173对II型糖尿病大鼠的降血糖机制

许 女，郭宏萍，杨 光，陈旭峰，张 茹，王如福*

（1 山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801 2 山西农业大学实验教学中心 山西太谷030801）

目前，全球的糖尿病发病率和糖尿病患者总数都呈逐年增加的趋势，我国的Ⅱ型糖尿病患病人数更是迅猛增长。由于降糖药物的使用具有副作用和引起胰腺的继发性衰竭[1]，所以目前人们逐渐将目光移向天然食品，寻求安全和理想的降糖保健食品。国内外研究表明，乳酸菌对预防和治疗糖尿病具有一定的作用，其可以通过调节宿主肠道菌群比例和免疫系统等，达到降糖和保护胰岛的目的。目前报道的具有降糖作用的乳酸菌有：嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、两歧双歧杆菌（B.bifidum）、植物乳杆菌（L.plantarum）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、加氏乳杆菌（L.gasseri）、约氏乳杆菌（L.johnsonii）、干酪乳杆菌（L.casei）和唾液链球菌（S.salivarius）等。涉及的机理包括：调节肠道菌群，提高肠道黏膜屏障功能；增强机体免疫功能；修复机体抗氧化损伤；促进胰岛素分泌，提高胰岛素敏感性；调节糖代谢相关的神经活性等[2]。

食醋具有降血糖的作用，可能是因为食醋对胰岛素分泌的响应和其对降血糖相关酶活性影响的结果。国内有临床报告证实：高血压或心血管病患者每天服用20 mL 果醋，半年后总胆固醇平均下降9.5%，血糖值下降11.2%，中性脂肪减少11.3%[3]。日本学者曾对17 名糖尿病患者进行了为期1 个月饮用醋蛋液的临床试验研究，结果有11人在饮用醋蛋液2～3 d 后，糖尿病症状明显改善[4]。乳酸菌是食醋发酵过程中的重要菌群，对食醋的风味、生理功能具有重要的贡献作用。本文主要研究分离自山西老陈醋醋醅中的一株植物乳杆菌173（L.plantarum 173）对II 型糖尿病大鼠的降血糖机制，为开发长效安全的预防糖尿病的微生态制剂进行了基础理论研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

植物乳杆菌173，山西农业大学食品科学与工程学院，生物工程实验室保存；TC（总胆固醇）、HDL-C（高密度脂蛋白-胆固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白-胆固醇）、TG（甘油三酯）测定试剂盒，购自北京中生北控公司；血糖、激素测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；总RNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RR036A 反转录试剂盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要仪器与设备

CFX96 荧光定量PCR 仪，美国BioRad 公司；Thermo 酶标仪，芬兰Thermo Electron 公司；电泳成套设备，美国Bio-rad 公司；凝胶成像系统，美国Alpha Innotech 公司；台式高速冷冻离心机，美国Sigam 公司；UItimate 3000 液相色谱仪，德国赛默飞公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌体发酵上清液和细胞提取液的制备 20株乳酸菌菌株经液体MRS 培养基活化后，按3%的接种量接种于MRS 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，8 000 r/min，离心10 min，分别收集上清及菌体。上清液以0.22 μm 滤膜过滤得试验用发酵上清；菌体用PBS 离心洗涤2 次后，再重悬PBS中，调节菌体浓度为1×109CFU/mL，超声破碎，将超声后的液体以10 000 r/min 离心20 min 后取其上清，经过0.22 μm 的滤膜过滤后得到细胞提取液。

1.3.2 菌株对α-葡萄糖苷酶活力的抑制率测定按照文献[5]中的方法，测定乳酸菌发酵上清和细胞提取液对α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）酶活性的抑制率。在150 μL PBS（0.1 mol/L pH 6.8）中加入75 μL 20 mmol/L 的对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）溶液及25 μL 待测乳酸菌的发酵上清或细胞提取液，37 ℃水浴10 min 后，加50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.17 U/mL）（空白对照加入50 μL pH 6.8 的0.1 mol/L PBS 溶液）继续37 ℃水浴10 min，加入1 mL 0.1 mol/L Na2CO3终止反应，于405 nm 处测吸光值。

酶抑制率（%）=[1-（C-D）/（A-B）]×100%

式中，A——含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含样品的测定吸光值；B——不含α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；C——含有α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；D——不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待测样品的测定吸光值。

1.3.3 菌株的耐酸、耐胆盐特性和对Caco-2 细胞的黏附测定 按照文献[6]中的方法，对乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性和对Caco-2 细胞的黏附率进行测定。

1.3.4 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立

1）模型建立 30 只健康8 周龄的大鼠（150±20）g，随机分为对照组10 只，模型组10 只，植物乳杆菌173 组10 只。前6 周，对照组饲喂基础饲料，模型组和植物乳杆菌173 组均定量饲喂高脂饲料，植物乳杆菌173 组每天灌胃受试菌液1 mL，其余组均灌胃生理盐水1 mL。在第7 周时，模型组和植物乳杆菌173 组采用链脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）腹腔注射诱导，对照组注射生理盐水，继续饲养到13 周试验结束后，处死大鼠，留取标本，测定指标。

2）饲料配方 高脂饲料：玉米粉（45%），维生素（1%），猪油（20%），酪蛋白（20%），骨粉（4%），蔗糖（10%）。普通饲料：玉米粉（50%），麸皮（25%），豆料（20%），骨粉（2%），鱼粉（2%），维生素（1%）。

3）受试液制备 将试验菌株植物乳杆菌173 按3%的接种量接于MRS 液体培养基中，37℃静置培养24 h，8 000 r/min，离心10 min，弃掉上清液，加入无菌生理盐水将菌体细胞洗涤2 次，并调节菌液浓度为1010CFU/mL。

4）指标测定

①大鼠血糖、血脂及激素水平的测定 按照文献[7]中的方法，采用试剂盒对大鼠血糖、血脂及激素水平进行测定。

②粪便菌群的测定 参考文献[8]中的方法，采用实时荧光定量PCR 技术对粪便中乳杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌和普氏拟杆菌的16S rDNA V3可变区进行定量分析。

③粪便有机酸含量的测定 收集大鼠新鲜粪便，测定其有机酸含量。取0.5 g 新鲜粪便，加入1 mL 蒸馏水混匀，用去离子水浸泡3 h→抽滤→12 000 r/min 离心10 min→取上清液于0.22 μm微孔滤膜滤样→进样检测。

色谱条件：液相色谱仪UItimate 3000；色谱柱选择Agilent ZORBAX-C18（4.6×150）mm，5 μm；流动相为pH 2.7 的20 mmol/L NaH2PO4；进样量20 μL；流动速度0.8 mL/min；紫外检测波长210 nm；柱温30 ℃。

④ 肝脏和肠道中糖尿病相关基因的表达提取肝脏和肠道中的RNA，按照文献[5，8]中的引物和试验方法，对肝脏PPARα、PPARγ、GLUT4 和肠道中GPR41、GPR43、ZO-1、Occludin、Claudin及MUC2 mRNA 的水平进行测定。

2 结果与讨论

2.1 具有降糖作用乳酸菌的筛选

微生物来源的酶抑制剂筛选研究成为糖尿病防治领域新的研究热点。糖尿病相关的代表性靶酶调节剂有醛糖还原酶抑制剂、糖原合酶激酶抑制剂、糖异生抑制剂等。α-葡萄糖苷酶抑制剂[9]通过延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的效果，通过竞争性抑制位于小肠的α-葡萄糖苷酶，使碳水化合物分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。研究发现某些植物或谷物的提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[10-11]。目前已报道的微生物来源α-葡萄糖苷酶抑制剂大多来源于链霉菌属，此外还有芽孢杆菌属、游动放线菌属和真菌，乳酸菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂报道比较少，Ramchandran 等[12]指出乳酸菌在体外具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

表1显示20 株乳酸菌发酵上清液对α-葡萄糖苷酶活力的抑制率在2%至31.22%范围内，普遍高于细胞提取物的抑制率（2.12%～25%）。其中3 株植物乳杆菌171，172，173 和1 株发酵乳杆菌179 发酵上清液对α-葡萄糖苷酶活力的抑制率最强，分别达到30.12%，31.22%，30.03%和29.56%。陈佩[5]研究也表明鼠李糖乳杆菌CCFM0528、乳双歧杆菌（B.lactis）CCFM7、两歧双岐杆菌CCFM16、干酪乳杆菌CCFM0412 和保加利亚乳杆菌 （L.bulgaricus）CCFM4 等菌株的发酵上清对α-葡萄糖苷酶也具有较高的抑制率（＞20%）。Ramchandran 等[12]推测可能是由于乳酸菌产生的多糖对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。

表1 具有降糖作用乳酸菌的筛选Table 1 Screening of hypoglycemic activity of LAB strains

2.2 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠体重的影响

鉴于植物乳杆菌173 的高α-葡萄糖苷酶抑制活性及良好的耐酸、耐胆盐特性和黏附性，采用植物乳杆菌173 进行后续动物实验的研究。糖尿病主要包含Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病的发病率（90%～95%）远高于Ⅰ型糖尿病。高脂高糖饲料喂养结合小剂量链脲菌素（STZ）建立的Ⅱ型糖尿病大鼠模型，具有血糖水平升高、胰岛β 细胞损伤、血脂异常和氧化应激损伤等特点。这种糖尿病模型与人类Ⅱ型糖尿病患者代谢类型具有相似的特点[8]，因此，该糖尿病动物模型建立方法具有广泛的应用。

由图1可知，前6 周，模型组和植物乳杆菌173 组体重均高于正常对照组（P＜0.05）。在STZ诱导造模期（第7 周），对照组大鼠体重逐渐增长，模型组和植物乳杆菌173 组体重均显著下降（P＜0.05），这是由于Ⅱ型糖尿病症状逐渐显现，同时大鼠出现毛色不洁，多饮多尿症状。之后，对照组体重平稳增长。模型组和植物乳杆菌173 组体重变化趋势相同，均在一段时间的下降之后，逐渐上升，试验结束时，平均体重分别达到300.11 g 和352.73 g，显著低于对照组大鼠的体重（387.45 g）。表明益生菌植物乳杆菌173 能够显著缓解Ⅱ型糖尿病大鼠的体重减轻病症。

图1 植物乳杆菌173 对各组大鼠体重变化的影响Fig.1 Effect of L.plantarum 173 on weight change of rats in each group

2.3 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠空腹血糖及糖耐受性的影响

图2 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠空腹血糖及糖耐受性影响Fig.2 Effect of L.plantarum 173 on blood glucose and AUC values in diabetic rats

葡萄糖不耐受是胰岛素抵抗Ⅱ型糖尿病一个重要的诊断指标。如图2所示，与对照组相比，模型组大鼠的空腹血糖值显著提高，而植物乳杆菌173 具有降血糖的功效。对照组和模型组大鼠7周和13 周的空腹血糖值没有明显变化，而植物乳杆菌173 组大鼠在第13 周的空腹血糖值相比第7周显著降低。在第7 周末，饲喂高脂饲料并且经STZ 处理组大鼠的葡萄糖耐受能力明显被降低，与对照组相比，血药浓度-时间曲线下面积（Area under the curve，AUC）值显著升高。但在试验结束时（第13 周末），灌胃植物乳杆菌173 组大鼠的糖耐受能力明显恢复，但AUC 值仍高于对照组。陈佩[5]和Li 等[8]也分别证明口服鼠李糖乳杆菌CCFM0528 和乳杆菌G15，Q14 可以显著改善高脂饲料-STZ 诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠和大鼠的葡萄糖耐受性。

2.4 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠激素水平的影响

Ⅱ型糖尿病是非胰岛素依赖型糖尿病，以高血糖、胰岛素抵抗和胰岛素相对缺乏为主要特征。Natali 等[13]报道，在60%～80%的Ⅱ型糖尿病病人中都呈现胰岛素抵抗性和相关代谢异常。如图3所示，糖尿病模型组血清胰岛素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）和瘦素（Leptin）水平显著高于正常对照组（P＜0.05）。灌胃植物乳杆菌173 后，3 种激素含量有所降低，其中胰高血糖素和瘦素水平更加接近正常对照组。糖尿病模型组胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide 1，GLP-1）和酪酪肽（Peptide tyrosine tyrosine，PYY）水平较正常对照组显著降低，灌胃植物乳杆菌植物乳杆菌173后，这两种激素水平有所提高（P＜0.05）。

图3 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠激素水平的影响Fig.3 Effect of L.plantarum 173 on hormones levels in diabetic rats

2.5 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠血脂水平的影响

图4显示，模型组和植物乳杆菌173 组大鼠血清中总胆固醇（Total cholesterol，TC）（7.84 mmol/L，4.86 mmol/L），甘油三酯（Triglyceride，TG）（10.03 mmol/L，6.85 mmol/L）和低密度脂蛋白-胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（3.16 mmol/L，1.67 mmol/L）较正常对照组（TC，2.04 mmol/L；TG，1.25 mmol/L；LDL-C，0.52 mmol/L）明显提高，HDL-C 水平3 组间差异不显著。血脂异常是糖尿病的常见特征。Li 等[8]也证明灌胃乳杆菌G15 和Q14 可以显著抑制高脂饲料诱导的糖尿病大鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的水平。粪便移植术的研究证实，肠道菌群产生的丁酸在调节血脂与血糖平衡中具有重要作用。

2.6 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠肝脏PPARα，PPARγ 及GLUT4 mRNA 表达量的影响

PPARs 是一类重要的调节炎性反应和葡萄糖平衡的基因，存在3 种亚型，PPARα、PPARδ 和PPARγ。PPARs 的激活可对胰岛素抵抗的改善发挥重要作用。PPARα 具有提高胰岛素敏感性的性能。PPARγ 主要在脂肪组织中表达，在胰岛素抵抗的治疗中起关键作用[14]。GLUT4 是存在于脂肪和骨骼肌组织的葡萄糖转运蛋白，80%以上的受胰岛素支配的葡萄糖在骨骼肌内消耗。PPARγ 的激活还可以减少血浆中游离脂肪酸的浓度而使之储存在脂肪组织中，并促进葡萄糖转运子GLUT-4 的表达，从而改善糖代谢[15]。

由图5可知，与对照组相比，模型组中PPARα 和GLUT4 的mRNA 表达量都显著降低 （P＜0.05），但PPARγ 的表达量却高于对照组。李川[16]在植物乳杆菌NCU116 及发酵胡萝卜汁对糖尿病大鼠的血糖改善机制研究中，也发现模型组大鼠血清中PPARγ 基因的表达量高于对照组，但陈佩[5]的研究却得出相反的结论。本文试验证明植物乳杆菌173 可以提高肝脏中PPARα，PPARγ 和GLUT4 mRNA 表达量改善胰岛素抵抗，从而降低小鼠的血糖水平。这与Zhang 等[17]和陈佩[5]报道的罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）GMNL-263，干酪乳杆菌（L.casei Zhang）和乳酸菌CCFM0412，CCFM0528可通过调节PPARs 和GLUT4 基因的表达促进葡萄糖稳态和提升胰岛素敏感性，来改善糖尿病的胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受的症状的研究结果相似。

图4 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠血脂水平的影响Fig.4 Effect of L.plantarum 173 on levels of serum lipids in diabetic rats

2.7 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠粪便菌群和短链脂肪酸的影响

图5 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠肝脏PPARα，PPARγ 及GLUT4 mRNA 表达量的影响Fig.5 Effect of L.plantarum 173 on liver relative PPARα，PPARγ and GLUT4 mRNA levels in diabetic rats

Neal 等[18]研究发现，饲喂高脂饮食能使肠道菌群失调，G-/G+菌比例增高，双歧杆菌、类杆菌和肠球菌减少，诱发机体出现糖尿病、肥胖症和炎症反应。相似的结果也在其它文献中被报道，证明肠道菌群与糖尿病的发生发展密切相关。由图6可知，与对照组相比，模型组大鼠粪便中乳杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifidobacteria）、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）和普氏拟杆菌（Bacteroides Prevotella）的数量显著降低，而植物乳杆菌173 对改善糖尿病大鼠肠道菌群有显著性效果。Li 等[8]也报道，相对于模型组，灌胃乳杆菌G15 和Q14 的糖尿病小鼠粪便中主要的乙酸产生菌—乳杆菌和双歧杆菌，及柔嫩梭菌（主要负责产丁酸）和普氏拟杆菌（主要产生乙酸和丁酸）的数量显著提高。别明江等[19]也发现，小鼠肠道益生菌的变化与血糖变化趋势呈负相关。

研究证实临床上服用酸奶或乳酸菌制剂，可增加肠道益生菌，在一定程度上抑制病原菌入侵和定植，调节肠道菌群平衡，提高肠道黏膜屏障功能，有效缓解及改善糖尿病症状[20]。乳酸菌可通过多种机制如分泌有机酸降低pH 值，营养竞争，控制内毒素，合成细菌素，减少肠腔内细菌易位，抑制病原菌的生长，黏附定植，占位，调节肠道菌群，促进胃肠蠕动，保证溶菌酶、蛋白分解酶的分泌，加强肠道紧密连接，保护肠道生物屏障，影响肠道先天免疫系统等方式，作用于肠道菌群的多方面，最终建立一个正常的共生菌群，直接或间接影响机体糖代谢，从而有效缓解及改善糖尿病症状。

图6 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠粪便菌群的影响Fig.6 Effect of L.plantarum 173 on fecal microbial population in diabetic rats

许多研究[21]结果表明，短链脂肪酸的摄入可以起到优化体脂组成、调节葡萄糖体内稳态和改善血脂代谢等保健作用。灌胃植物乳杆菌173 可以显著提高糖尿病大鼠粪便中短链脂肪酸的含量，使其接近正常水平。Aoki 等[22]也报道，给糖尿病小鼠补充乳杆菌和双歧杆菌，可以提高肠道中短链脂肪酸的产生。Vadder 等[23]证明补充丙酸或丁酸可以缓解糖尿病小鼠的体重减轻病症，并改善糖耐受性。

图7 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠粪便菌短链脂肪酸的影响Fig.7 Effect of L.plantarum 173 on fecal short chain fatty acid content in diabetic rats

2.8 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠肠道GPR41，GPR43，ZO-1，Occludin，Claudin 及MUC2 mRNA 表达量的影响

研究表明[24]，短链脂肪酸发挥降糖功能主要是通过活化G-蛋白受体 （如GPR43，GPR41），从而提高肠道内GLP-1 的分泌量而发挥作用的。与模型组相比，植物乳杆菌173 处理组大鼠肠道中GPR43 和GPR41 基因的表达量显著提高，接近对照组。其中，GPR43 基因上调表达与Li 等[8]的研究结果相似，但对于GPR41 基因的表达，文献[8]中试验结果却显示没有显著变化。

乳酸菌可以通过保护肠道黏膜屏障，影响肠道先天免疫系统等方式，作用于肠道菌群的多方面，最终建立一个正常的共生菌群，直接或间接的影响机体糖代谢，从而有效缓解及改善糖尿病症状。Cani 等[25]报道，高脂饮食可以显著下调肠道紧密连结蛋白ZO-1、Claudin、Occludin 基因的表达，导致肠道黏膜通透性增加。Strowski 等[26]证明益生菌可以提高激素分泌从而促进肠道黏蛋白MUC的表达，增强肠道黏膜屏障功能。图8结果显示，植物乳杆菌173 可以有效改善糖尿病大鼠肠道屏障的完整性、通透性及黏蛋白等相关基因表达水平的变化。

3 结论

图8 植物乳杆菌173 对糖尿病大鼠肠道GPR41、GPR43、ZO-1、Occludin、Claudin 及MUC2 mRNA表达量的影响Fig.8 Effect of L.plantarum 173 on intestinal GPR41，GPR43，ZO-1，Occludin，Claudin and MUC2 mRNA levels in diabetic rats

本文对山西老陈醋醋醅中分离筛选出的一株益生菌——植物乳杆菌173 的降血糖功能及机制进行了研究。最终证明植物乳杆菌173 主要通过调节大鼠肝脏中炎性反应和葡萄糖平衡基因及肠道紧密连结蛋白、黏蛋白等相关基因的表达，维持葡萄糖稳态和提升胰岛素敏感性，提高肠道内短链脂肪酸产生菌的数量，增强肠道黏膜屏障等途径协同发挥降糖功能，为开发醋醅来源益生菌的糖尿病微生态制剂提供了理论依据。