食物提供充足营养时3种常见饮水对斑马鱼幼鱼抗氧化能力的影响

常 成，陈艺煊，曹菲薇，陈 娟，郑炀凡，朱加进

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310000）

青春期是机体生长发育的重要时期，它决定着人的体质、智力和精神状态[1]。青少年能否健康成长不仅受遗传因素的影响，而且与适当的营养，特别是各种宏观和微量元素密切相关[2]。长期以来，我国居民膳食结构不合理，钙、锌、硒、镁缺乏严重[3]，而在所有人群中，11～13 岁的青少年膳食中矿物元素水平达到DRI （膳食营养素参考摄入量）的比例最低。同样的，美国的调查数据也显示，8～19 岁的青少年、儿童膳食钙摄入量达到AI（适宜摄入量）的比例最低[4]。除摄食外，机体还可通过饮水获取矿物元素。关于饮水这一途径，国内外存在广泛的争议：一种观点认为，人体所需的矿物元素95%是由膳食提供，没有必要通过饮水获得；另一种观点则认为，水中的矿物元素以离子态存在，相较于食物具有明显较高的生物利用度[5]，因此饮水是机体获取矿物元素不可缺少的途径。此外，最近的研究发现，通过摄食获取矿物元素有增加能量摄入的风险，相反的，饮水则可以通过被称为“水诱导热生成” 的机制提高REE （静息能量消耗），对于减少青少年的肥胖率具有重要的现实意义[6-8]。

由于青少年的大部分活动在学校完成，实际上可供他们选择的日常饮水为白开水和瓶装水。作为白开水原料的自来水，提供了机体每日所需锌摄取量的10%[9]，然而，自来水易受生物和化学污染[10]，在自来水消毒过程中，各种消毒剂可在水中产生DBPs（消毒副产物），特别是三氯甲烷[11-12]。此外，自来水管道和水龙头中的铜也可能浸出进入自来水中[13-14]，因此，消毒剂和DBPs 带来的不愉快气味和重金属暴露使得人们越来越多地选择瓶装饮用水。市场上最受欢迎的瓶装饮用水是瓶装天然水和瓶装纯净水，由于水源和过滤方式的不同，瓶装纯净水几乎不含矿物元素，而瓶装天然水则含有一定量的矿物元素。

研究发现，3 种常见饮水的成分和矿物元素含量不同，可能对机体健康产生不同的影响。长期饮用纯净水会导致镁摄入不足[15-16]，对脂蛋白代谢和脂质过氧化产生负面影响[17-18]。在水中添加锌可促使虾虎鱼增加脂肪分解，减少脂肪生成[19]。此外，软水区的冠心病或其它心血管疾病的死亡率高于硬水区[20-21]。也有研究发现3 种饮用水对一些发育指标并无差异。王娟等[22]观察到大鼠饮用3种水1年后，其尿、血液、毛发和肝脏中氟、铜、铁、锌、锶的含量没有差异；Zhao 等[23]发现长期饮用纯净水的大鼠与饮用自来水的大鼠相比，亲代体重、繁殖、子代生长发育无明显差异。

斑马鱼（Danio rerio）是一种新型模式脊椎动物，其基因与人类同源性高达87%[24]，具有许多其它传统模式动物所不具备的优点，如体积小，生命周期短，易于饲养等。此外，斑马鱼是一种体外受精和体外发育的动物，生理过程与人类非常相似[25]，广受科研人员的青睐。研究发现，水环境对斑马鱼的生长发育、生理和病理都有很大的影响[26]。将斑马鱼用于水质安全检测，在国内外已得到公认和广泛应用。鉴于国际社会对饮食状态下日常饮水的争议，加之以往的研究大多集中于不同饮用水对妇女和中老年人群的影响，很少有研究比较长期饮水对青少年人群机体的影响，本研究比较了在膳食提供充足矿物元素的情况下，3 种常见饮水对斑马鱼幼鱼的发育行为、脂代谢和抗氧化能力的影响，并分析何种矿物元素造成这些差异，旨在为处于人生重要阶段的青少年的日常饮水选择提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物 斑马鱼（Danio rerio）〔许可证编号：ZJU（浙江大学）2015-8-26-004Y〕，体长（4.754±0.159）mm，浙江大学动物科学学院教育部分子动物营养重点实验室（杭州）。

1.1.2 试剂 海盐，浙江海蓝星盐制品有限公司；丰年虾（Artemia）卵，天津丰年水产养殖有限公司；固体颗粒饲料（粗蛋白＞50.0%，粗脂肪＞12.0%，粗纤维＜2.5%），Zeigler larval；MS222，Sigma-Aldrich。

所有试剂盒均购自南京建城生物工程研究所。总蛋白定量测定试剂盒A045-2；甘油三酯（TG）测定试剂盒A110-2；总胆固醇（TC）测定试剂盒A111-2；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒A112-2；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒A113-2；丙二醛 （MDA）测定试剂盒A003-1；总胆固醇超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒A001-1-1。

1.1.3 水样与饮食 养鱼水为0.06 g 海盐和1 L蒸馏水（最终质量浓度约为0.06 mg/mL）的混合物；自来水为曝气24 h 后的杭州市市政自来水；瓶装天然水和瓶装纯净水购自超市。21～30 dpf（受精后天数）斑马鱼每日喂食2～3 次新鲜孵化的丰年虾幼虫；30 dpf 后的斑马鱼每日喂食2～3 次新鲜孵化的丰年虾幼虫和固体颗粒饲料。

1.1.4 仪器设备 原子吸收光谱仪（AA240 型），Varian；电感耦合等离子体发射光谱仪 （730-ES型），Varian；pH 计，METTLER TOLEDO；电导率测定仪（HI98303 型），HANNA；数字鼓风机干燥器（GZX-9030MBE 型），BOXUN；智能生化培养箱，SPX；超声破碎机（DL-1000D 型），ZhiXin；离心机（T3，15A 型），ThermoScientific；双光束紫外可见分光光度计（TU-1900 型），PERSEE。

1.2 试验设计

如图1所示，将21 dpf 斑马鱼幼鱼（体长4.754 mm±0.159 mm，n=240）随机分为4 组：FWG（养鱼水组，对照组）、PWG（纯水组）、NWG（天然水组）和TWG（自来水组），每组20 尾，每组设置3个平行。每组斑马鱼在相应的水样中饲养，每日更换1/3 的新鲜水样以确保水中溶解氧水平。所有斑马鱼在试验期间均饲喂相同的食物，以排除食物中的矿物元素对试验结果的干扰。斑马鱼自由进食，保证每次喂食在5 min 内摄食完成。

1.3 指标观察与测定

1.3.1 水样水质与组分的测定 根据GB5749-2006 和GB-7489-1987，测定4 种水样的pH 值、总溶解固体（TDS）、溶解氧（DO）和钾、钙、钠、镁、铁、锌、铜含量。其中，玻璃电极法测定pH 值；称重法测定TDS，干燥温度（105±3）℃；吲哚法测定DO；火焰原子吸收光谱法测定钾含量；电感耦合等离子体原子发射光谱法测定钙、钠、镁、铁、锌和铜的含量。

2011年3月召开的全国人大会议上通过了 “十二五”规划。“十二五”规划在税收方面提出“扩大增值税征收范围，相应调减营业税等税收”的任务。这是继2009年进行增值税转型以后再次进行的关于增值税的改革。目前，扩大增值税征收范围改革已经进行了三年，改革成果有喜有忧，笔者通过对近三年来扩大增值税征收范围改革的成果进行总结归纳，提出自己的见解，为扩大增值税征收范围改革建言献策，推动改革早日完成。

1.3.2 存活率记录 在整个试验阶段，每天记录各组斑马鱼的死亡尾数并绘制存活率曲线。

1.3.3 90 dpf 斑马鱼体重和体长的测定 试验结束前24 h，所有斑马鱼停止进食。试验当天，用MS222（Sigma-Aldrich）对斑马鱼进行安乐死，用滤纸彻底吸收斑马鱼表面残留的水分后测量全鱼的体重和体长。

图1 试验设计示意图Fig.1 Schematic illustration of the study design

1.3.4 90 dpf 斑 马 鱼 体 内K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu 含量的测定 斑马鱼安乐死后，按质量（g）∶体积（mL）=1∶9，加入生理盐水，在冰水浴中用超声波破碎机匀浆，直到组织混合物均匀化，4 ℃，5 000×g 离心30 min 后取上清液得到10%的斑马鱼匀浆。稀释10 次后，用火焰原子吸收光谱法测定全鱼K 含量，电感耦合等离子体原子发射光谱法测定Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu 含量。

1.3.5 90 dpf 斑马鱼脂代谢指标的测定 根据相应的试剂盒说明书测定全鱼蛋白质、TG、TC、HDL-C 和LDL-C 水平。

1.3.6 90 dpf 斑马鱼抗氧化能力指标的测定 根据相应的试剂盒说明书测定全鱼SOD 活性和MDA 水平。

1.4 数据处理

采用SPSS 16 统计软件进行统计学分析，数据采用单因素方差分析和LSD 检验进行分析。采用Pearson 二元相关分析法，对水样组分与斑马鱼生长发育、脂代谢及抗氧化指标之间的相关性进行分析。所有数据均以±s 表示，P ＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 4 种水样的水质指标与组分含量

如表1所示，与自来水相比，2 种瓶装水的pH 值和TDS 水平较低，但DO 水平较高，此外，天然水的pH、TDS 和DO 水平高于纯净水；自来水中的钾、钠、钙、镁等矿物元素含量高于瓶装水，天然水中的矿物元素含量高于纯净水；纯净水的钙镁比为13∶1，养鱼水3∶1，天然水7∶1，自来水8∶1；自来水中锌含量最高。此外，4 种水样中的铁和铜含量均远远低于GB 5749-2006 规定的限值（铁＜0.3 mg/L，铜＜1.0 mg/L）。

表1 4 种水样的水质指标和组分含量Table 1 The water quality indexes and components of the four waters

2.2 4 种水样中斑马鱼的发育行为

如图2所示，试验第1 天，PWG 和NWG 中有数尾斑马鱼幼鱼发生死亡，导致存活率低于FWG和TWG；25 dpf，PWG 中斑马鱼幼鱼继续大量死亡，TWG 中斑马鱼幼鱼开始出现死亡现象，而FWG 和NWG 中的死亡率趋于平缓；60 dpf，NWG、TWG 和FWG 中的斑马鱼幼鱼均停止死亡，而PWG 中仍有少数死亡；90 dpf，PWG 中斑马鱼的生存率最低，其余3 组生存率无显著差异。

图2 21～90 dpf 4 组水样中斑马鱼幼鱼的存活率曲线Fig.2 The survival curve of zebrafish juvenile in four groups from 21 dpf to 90 dpf

2.3 90 dpf 斑马鱼体内K、Na、Ca、Mg、Fe、Cu和Zn 含量

4 组间K、Na、Mg、Cu 含量无显著差异（图3a、b、d、g）；PWG 中斑马鱼体内Ca 含量显著低于NWG 和TWG（P=0.013，0.022）（图3c）；FWG 中斑马鱼体内Fe 含量显著高于其它3 组，PWG 中斑马鱼体内Fe 含量极显著高于TWG （P=0.009）（图3e）；PWG 中斑马鱼体内Zn 含量显著低于TWG（P=0.048）（图3f）。

表2 90 dpf 各组斑马鱼的体重和体长Table 2 The body weight and body length of 90 dpf zebrafish

图3 4 种水样中90 dpf 斑马鱼体内矿物元素含量Fig.3 The mineral levels of 90 dpf zebrafish in four different waters

2.4 90 dpf 斑马鱼脂代谢水平

90 dpf，TWG 中斑马鱼体内TG 含量较FWG组显著下降，PWG 中斑马鱼体内TG 含量显著高于NWG （P=0.016）和TWG （P=0.001）（图4a）；NWG 中斑马鱼体内HDL-C 水平显著高于FWG和PWG （P=0.002，0.041）（图4c）；4 组间TC 和LDL-C 水平无显著差异（图4b、d）。

图4 90 dpf 斑马鱼体内TG 水平（a）、TC 水平（b）、HDL-C 水平（c）和LDL-C 水平（d）Fig.4 90 dpf zebrafish TG level （a），TC level （b），HDL-C level （c）and LDL-C level （d）

2.5 90 dpf 斑马鱼抗氧化能力

90 dpf，4 组水样中斑马鱼SOD 活性无显著差异 （图5a）；PWG 中斑马鱼MDA 水平显著高于NWG（图5b）。

图5 90 dpf 斑马鱼SOD 活性（a）和MDA 水平（b）Fig.5 90 dpf zebrafish SOD activity （a）and MDA level （b）

2.6 4 种水样的组分与90 dpf 斑马鱼体内矿物元素含量、发育参数、脂代谢指标、抗氧化能力的关系

如表3所示，90 dpf 斑马鱼的存活率与几乎所有的水样指标与组分有关；体长与水样中Ca（P=0.040）和Mg 含量（P=0.020）呈正相关；TG 水平与水中K 含量呈正相关（P=0.001），而与水中Ca（P=0.001）、Mg（P=0.000）、Fe（P=0.010）和Zn（P=0.010）含量呈负相关；HDL-C 水平与水中Na 含量呈负相关（P=0.022）。

3 讨论

3.1 不同饮水对斑马鱼幼鱼发育行为的影响

Lawrence[27]发现大多数淡水鱼适宜在pH 7.0～8.0 内的水体中生存，Naddy 等[28]发现天然水体中的Ca∶Mg 在1.6∶1～8∶1 间，也就是说，除了瓶装纯净水外，本试验中其它3 种水样都适合斑马鱼幼鱼的生长发育，这与我们所得的生存率曲线结果一致（图2）。此外，值得注意的是，自来水DO仅为1.68 mg/L，低于Erickstad 等[29]建议的鱼类死亡和回避行为的下限值2.8 mg/L。然而，我们并未在TWG 中观察到斑马鱼幼鱼的任何异常行为，推测有两个原因：第一，本试验所使用的斑马鱼（21 dpf）比Erickstad 等[29]试验所使用的斑马鱼（7 dpf）日龄大，因而抵抗能力与适应能力更强；第二，当水体中DO 降至3 mg/L 以下时，斑马鱼能迅速提高SOD 活性以适应轻度缺氧，直到DO＜1 mg/L 才会发生氧化损伤[30]，这与我们观察到的TWG 中斑马鱼幼鱼体内SOD 活性有上升趋势的现象相一致（图5a）。

有研究报道饮用纯净水能显著降低缺镁饮食大鼠的体重[31]，青春期前的钙摄入量严重影响青少年的身高增长[32-35]，钙摄入低于300 mg/d 可能会导致成人身高变矮[36]。我们的试验结果发现，PWG 中斑马鱼幼鱼的体重和体长显著下降，与前人的研究结果相一致。相关分析表明，斑马鱼幼鱼的体长与水中Ca、Mg 的含量呈显著正相关，体重与体内Zn 含量呈显著正相关，而幼鱼体内Zn 含量又与水中Ca、Mg 的含量呈显著正相关。因此，可以得到结论：纯净水组斑马鱼幼鱼的体重和体长显著降低可能是由于纯净水中缺乏钙和镁所致。

3.2 不同饮水对斑马鱼幼鱼脂代谢的影响

冠状动脉疾病已经成为当今世界人口死亡的主要原因，多种现象提示疾病的早期发生，包括低HDL-C、高LDL-C、高TC、高TG[37]。相关分析表明，斑马鱼幼鱼TG 水平与水样中Ca、Mg、Fe、Zn的水平呈显著负相关，与水样中K 的水平呈显著正相关。Papakonstantinou 等[38]发现喂食高钙饮食的老鼠比对照组的老鼠胴体脂肪减少29%。研究表明，高浓度的钙至少通过2 种机制抑制膳食脂肪酸的吸收：第一，抑制相关的循环激素水平，如25-羟基维生素D、1，25-二羟基维生素D 和甲状旁腺激素[39]；第二，促进胃肠道中不可消化钙皂的形成[40-41]。此外，Ravn 等[42]发现，当实验动物接受具有足够镁含量的标准小鼠食物时，镁能显著降低ApoE-/-小鼠体内的TG 水平，然而，Orimo 等[43]发现，胆固醇饮食喂养的兔子并无脂质水平的差异。这两项研究结果不一致的原因可能与前一研究中镁是通过饮水干预而后一研究中则是通过膳食干预有关。

相关分析还表明，斑马鱼幼鱼体内HDL-C 水平与水样中Ca、Mg 水平呈显著正相关，与Na 水平呈显著负相关。这一结果与前人的一些研究相一致：Delisle 等[44]发现正常HDL-C 水平人群的钙摄入量明显高于低HDL-C 水平人群，并且HDLC 水平随着镁摄入量的增加而显著升高[45]；Choi等[46]提示膳食钠摄入量与血清HDL-C 水平呈负相关。然而，也存在一些研究结果不一致：Aslanabadi 等[47]发现，摄取富含钙、碳酸氢镁和硫酸盐的矿泉水1 个月后，血脂异常的成年人群的TC 和LDL-C 水平显著下降，但TG 和HDL-C 水平无显著变化。我们推测这可能是由于他们的试验对照组使用的水含有比本试验明显较高的钙（7 mg/L）和镁（1.7 mg/L）。由此可见，纯净水组斑马鱼幼鱼体内TG 和HDL-C 水平的显著下降是由于瓶装纯净水中钙、镁的缺乏。

3.3 不同饮水对斑马鱼幼鱼抗氧化能力的影响

Zn 0.907**0.542-0.099 0.741*0.132 0.771*0.843**-0.502 0.522-0.275-0.799*0.145-0.206-0.055析分性关相的力能化氧、抗标指谢代、脂数参育、发量含素元物矿内体鱼马90 dpf 斑与分组的样水4 种3表Correlation analysis of the relationship among water constituents，90 dpf zebrafish mineral levels，developmental parameters，Table 3 lipid metabolism and antioxidant parameters Fe Mg Ca MDA SOD LDL-C HDL-C TC TG长体重体率存生-0.214 0.211 0.132-0.233 0.255 0.228 0.136 0.134 0.539**0.321*0.286*0.733**pH样水0.57-0.027 0.191-0.147 0.3 0.053-0.279 0.192-0.221 0.127 0.167 0.860**TDS样水0.102 0.164 0.400-0.194-0.319*0.006 0.290-0.365*0.172 0.095-0.005-0.194 DO样水-0.433 0.154-0.08-0.103 0.269 0.203 0.118 0.203 0.505**0.235 0.224 0.5**K样水0.936**-0.143 0.312-0.104 0.157-0.076-0.374*0.075 0.085-0.004 0.039 0.64**Na样水-0.554 0.216-0.039-0.139 0.212 0.231 0.229 0.141-0.522**0.273*0.239 0.434**Ca样水-0.462 0.234 0.041-0.188 0.216 0.241 0.227 0.122-0.54**0.307*0.265 0.538**Mg样水0.495-0.051 0.277-0.036-0.285-0.144-0.021-0.277-0.414**-0.113-0.142-0.293*Fe样水-0.417 0.041-0.252 0.026 0.302 0.139-0.014 0.286-0.413*0.115 0.147 0.356**Zn样水0.222 0.09 0.353-0.133-0.327*-0.051 0.198-0.349*0.274 0.014-0.064-0.275*Cu样水0.005 0.653*0.187 0.082-0.351-0.163-0.011*-0.115-0.6-0.605*-0.793**-0.032 Na鱼马斑0.19 0.583 1-0.249-0.295-0.286 0.185-0.554**-0.37 0.109-0.068 0.452*Ca鱼马斑-0.132 1 0.583 0.098-0.111 0.268 0.483-0.33-0.677*-0.255-0.59 0.168 Mg鱼马斑-0.206 0.145 0.161 0.344 0.702 0.794*-0.111-0.218 0.761*0.768*0.839**Zn鱼马斑：*P＜0.05；**P＜0.01。注

超氧化物歧化酶（SOD，一种催化超氧自由基歧化成氧气或过氧化氢的酶）是机体细胞抗氧化剂对ROS 和脂质过氧化造成的氧化损伤的第一道保护线[48]，研究发现鱼能够利用SOD 将超氧化物歧化为氧[49]。有趣的是，本研究发现斑马鱼幼鱼体内的SOD 活性并未受到不同水样的影响，说明所有组斑马鱼幼鱼都表现出相似的抗氧化能力，这一结果与其它对海水鱼类的研究不一致，但与对亚淡水鱼类的研究结果一致[50-52]。原因可能是淡水鱼类通常比海水鱼类暴露于更宽pH 范围的水体中，因此0.8 单位的pH 变化不足以诱导氧化应激反应的发生。此外，研究发现镁具有抗脂质过氧化作用[53]，并能维持SOD 活性[54]。Han 等[55]发现，当膳食补充1 mg/kg 镁时，高氟牛体内SOD 活性显著增加。这些研究也与本研究结果不一致，可能是因为在本试验中各水样中镁含量只有很小的差异，并且斑马鱼并未处于氧化应激状态。

一旦自由基突破生物体对氧化的防线，ROS即可攻击诱导氧化损伤的细胞分子，MDA 水平被认为是脂质过氧化最重要的表现之一[56-57]，因此可以通过测量MDA 水平来评估斑马鱼幼体脂质过氧化的水平。本试验结果与前人相一致，纯净水中斑马鱼幼鱼体内MDA 水平的显著增加可能归因于水样中镁的缺乏，镁具有抗脂质过氧化作用，镁缺乏导致脂质过氧化增加，镁缺乏动物对氧化应激比正常动物更敏感。

4 结论

3 种常见饮水相比较，瓶装天然水具有适宜的pH 和DO、适量的矿物元素水平以及合理的钙镁比，对斑马鱼幼鱼的生长发育、脂质代谢和抗氧化能力表现最佳，自来水次之，而瓶装纯净水则由于缺乏钙、镁而不适合斑马鱼幼鱼的生长与健康发育。本研究表明，即使在膳食能够提供充足的矿物元素的情况下，长期饮用纯净水仍会对机体发育、脂质代谢和抗氧化能力产生一定的不利影响，这为消费者特别是处于生长发育重要阶段的青少年选择适当的饮水提供了一定的参考。