侗医药松杖方对类风湿关节炎患者滑膜细胞STAT3炎症信号表达的影响

安 阳，马武开，黄 颖，曹跃朋，宁乔怡，刘 静,杨庆万，项飞燕

(1.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003；2.贵州省遵义市第一人民医院，贵州 遵义 563000)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以反复发作的四肢对称性多关节肿胀、疼痛、功能障碍甚至关节畸形为特点的慢性自身免疫性疾病，基本病理表现为慢性滑膜炎。研究认为白介素17(Interleukin 17，IL-17)与RA的疾病进程紧密相关[1]，它主要由辅助性T细胞17(T Helper 17 cell，Th17)分泌,而信号转导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)则通过调控核基因转录，控制着Th17的分化与成熟，并由此调控多种下游细胞因子如IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等的表达[2]，最终形成STAT3-Th17正反馈通路，使炎症信号逐渐放大。因此，针对STAT3的靶向调控，即可下调Th17的分化，有效控制RA的滑膜炎症。松杖方是民间侗医药经验方，用于临床中取得较好疗效[3-4]。本研究通过松杖方的兔含药血清干预的方法，观察对人RAFS中STAT3及相关蛋白孤核受体γt(Orphan nuclear receptor gammat，ROR-γt)、细胞因子信号转导抑制分子3(Suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)的影响，探讨松杖方的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 滑膜细胞来源:滑膜组织取自贵州中医药大学(原贵阳中医学院)第二附属医院骨科行关节置换术及我科行关节镜诊疗术的RA患者，标本的获取均通过患者知情同意。RA 的诊断符合ACR1987 年分类标准或EULAR2010年分类标准，并除外合并有感染、肿瘤、其他风湿病等情况，3个月内未使用慢作用抗风湿药。

1.1.2 试剂及药物:松杖方由松萝、虎杖组成，两药各等分。雷公藤多苷(贵州汉方制药有限公司)；来氟米特片(苏州长征-欣凯制药有限公司)；DMEM 高糖培养基(HyClone)；胰酶(HyClone)；胎牛血清(Gibico)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；ROR-γt、SOCS-3及pSTAT3检测试剂(英国ABCAM 公司)；细胞凋亡检测试剂盒(Yeasen公司)。

1.1.3 仪器:恒温培养箱(SANYO，MCO-20AIC，日本)；高速离心机(Eppendorf，5810R，德国)；显微镜(CKX-41，Olympus)；酶标仪(BioTek，EL×800 V，美国)。

1.1.4 实验动物及含药血清制备:新西兰大白兔36只(贵阳中医学院动物实验中心提供)，雌雄各半，SF级，体重(2.0±0.2)kg。随机分为六组，每组6只，即空白组、松杖方高、中、低剂量组、来氟米特组和雷公藤多苷组。松杖方高、中、低剂量组分别灌服成人等效剂量9倍、6倍、3倍生药量溶液，雷公藤多苷对照组及来氟米特对照组灌服成人等效剂量雷公藤多苷和来氟米特混悬液，每天1次，连续1周，于末次给药2 h后无菌条件下心脏取血，分离血清，组内血清混合，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置-20 ℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与鉴定:充分分离RA滑膜组织，用PBS液清洗2遍，并剪成1 mm×1 mm大小的组织块，放置在无菌瓶内，经胰酶消化、离心处理后，取细胞置于DMEM培养基中，于37 ℃、5 %的CO2条件下培养24 h后，更换培养液，传代至第3～5代，流式细胞仪检测鉴定。取3代生长活跃的细胞进行实验，根据分组给予相应含药血清干预。

1.2.2 给药剂量：根据人与兔体重换算公式进行计算，成人所需松杖方生药量为1.05 g/kg，该剂量为低剂量，3倍为中剂量，9倍为高剂量，实验时以PBS液稀释含药血清成相应浓度，取相应药量；雷公藤多苷2.1 mg/kg，来氟米特0.7 mg/kg。实验中直接给予相应剂量含药血清。

1.2.3 流式细胞术检测药物对RASF细胞增殖的影响:取3代对数生长期RASF消化离心后，以10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，接种至96孔板，细胞浓度约为5×104个/ml。实验分设空白组、来氟米特组、雷公藤多苷组、松杖方高、中、低剂量实验组，每组设3个复孔。取相应含药血清加入每孔中干预，继续培养24 h后，收取细胞，按常规操作流式细胞仪检测RAFS的凋亡情况。每组样品检测6次，采用FASCDiva软件分析检测结果。

1.2.4 Western blot法检测RASF细胞ROR-γt、SOCS-3和STAT3、pSTAT3蛋白表达水平的影响:将PBMC或滑膜细胞低温匀浆后加蛋白裂解液，置冰上40 min，4 ℃12000 r/min离心10 min，取上清。以BSA为标准，用Bradford 法对上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37 ℃封闭1 h；一抗4 ℃过夜。用不含抗体TBS-T液孵育作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶(AP) 标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1 h，洗膜后，用免疫印迹观察，用图像分析测定各带吸光度(A)值做定量分析。

2 结 果

2.1 细胞形态的观察 滑膜组织培养3～5 d，镜下呈梭形、多角形、星形等多种形态，细胞呈漩涡状排列生长，传至3～5代后，RAFS生长密集，形态趋向于梭形，大小均一，折光性强，呈平行样或者漩涡状排列增殖，增殖速度较快。随着传代次数增多，细胞质中出现颗粒物质，生长缓慢，光亮度逐渐下降。本研究选择3代细胞(图1)。

图1 滑膜细胞形态图

2.2 松杖方含药血清对RAFS凋亡的影响 检测结果分析，各含药血清干预组RAFS凋亡率与空白组比较均显著升高(P<0.05)，松杖方含药血清组细胞凋亡率与药物浓度相关；松杖方中剂量组与雷公藤多苷组、来氟米特组间比较差异无统计学意义;松杖方高剂量组RAFS凋亡率最高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 松杖方含药血清对RA滑膜细胞凋亡的影响(%)

2.3 松杖方含药血清对RASF的ROR-γt、SOCS-3和pSTAT3蛋白表达水平的影响 与空白组比较，各含药血清干预组RAFS中ROR-γt、pSTAT3的表达量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)，其中松杖方高剂量组ROR-γt、pSTAT3的表达量最低，与雷公藤多苷组及来氟米特组比较，差异有统计学意义 (P<0.05)。而各含药血清干预组RAFS中SOCS-3的表达量差异未见统计学意义 (P>0.05)。见表2(图2)。

表2 松杖方含药血清对RAFS的ROR-γt、SOCS-3、STAT3表达水平的影响

1.正常对照组；2.松杖方低剂量组；3.松杖方中剂量组；4.松杖方高剂量组；5.雷公藤多苷组；6.来氟米特组

3 讨 论

RA是以关节滑膜炎症损伤为特征的自身免疫性疾病，其发病机制复杂，有多种细胞因子参与其发病过程，而STAT3介导的炎症通路占据重要地位[5-6]。STAT3属于一类胞浆蛋白家族，在体内参与了多种炎症因子的信号转导过程，并参与调控滑膜细胞、T细胞等的增殖、分化。当IL-6、TGF-β与细胞膜上受体结合后，使JAK活化并招募STAT3蛋白并使其磷酸化，pSTAT3蛋白具有生物活性，以二聚体形式进入细胞核启动转录程序，表达ROR-γt，激活ROR-γt信号传导通路，从而介导初始T细胞向Th17分化[7-8]，导致大量炎症因子生成并形成正反馈，进一步活化STAT3。STAT3活化后同时具有调控RAFS的增殖、分化、凋亡以及释放炎症因子的能力[9-10]，细胞因子具有强大的致炎功能，可直接作用于关节滑膜组织，导致滑膜炎症持续、血管翳形成。

ROR-γt是类固醇激素受体家族成员，是重要的介导炎症因子转录的调节因子，通过STAT3发挥作用。ROR-γt可以增强IL-17 mRNA转录，上调IL-17的水平[11-12]，继而激活NF-κB通路并导致NF-κB相关炎症因子如IL-1、IL-6、TNF-α等活性增强，促使多种炎症因子协同作用[13],STAT3与细胞因子成相互促进的作用，最终形成STAT3-ROR-γt -Th17-炎症因子-滑膜炎的环形炎症轴链。而SOCS-3则可以抑制STAT3活性。SOCS是一类新型的细胞因子转导抑制蛋白，其家族成员大都参与JAK-STAT信号通路的负反馈调节，而SOCS-3是其中之一，具有较强的生物活性。一旦抑制了STAT3的活性、破坏了环形炎症轴链，就可以阻止滑膜炎症。

侗药的“风湿痛”与RA的临床表现相符，该病因正气不足、感受外邪，机体功能失调之后滋生内热，是发病的关键，故治疗上在“赶邪”时，也清内在“邪热”。松杖方有松萝、虎杖组成，具有祛风除湿、通络止痛、清热解毒、消肿理气的功效，现代研究证实松萝具有抑制炎症、降低血清炎症因子水平、抑制毛细血管生成等功效[14-15]，前期动物实验证实松杖方可抑制CIA大鼠NF-κB信号通路，减少IL-1、TNF-α的分泌[16-17]。本研究显示中、高剂量的松杖方可下调pSTAT3的表达，各剂量组均可下调ROR-γt的表达，抑制强度与药物剂量相关。说明松杖方可同时抑制ROR-γt、pSTAT3的基因表达，抑制炎症信号的传导，促进RAFS凋亡，阻断RA炎症持续发生。