Purmorphamine对脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡影响的实验研究

朱美霖，白宏英

(1.山东省济宁市第一人民医院老年医学科，山东 济宁 272000；2.郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450000)

脑缺血性疾病是一种高发性、高致死率的严重影响人类健康的一种疾病。近年来我国脑缺血性疾病的致死率位居首位[1]。脑缺血再灌注损伤一直是研究的热点，脑缺血再灌注机制包括炎症、氧化应激、细胞凋亡、钙超载、能量障碍等多种因素。脑缺血时可激活凋亡蛋白的表达，引起脑细胞的凋亡，尽早进行抗细胞凋亡治疗是减少神经损伤的重要一环。在细胞凋亡过程中B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2)、Bcl-2相关X蛋白(BCL2-Associated X)与细胞凋亡有着密切关系，其中Bcl-2对脑细胞凋亡起到抑制作用，而Bax对细胞凋亡具有促进作用[2]。Purmorphamine(PM)是一种无毒性小分子的嘌呤衍生物，可以激活Sonic Hedgehog信号通路。有研究表明PM可以透过血脑屏障，在神经系统疾病中发挥抗炎作用，而在蛛网膜下腔出血中具有神经保护作用[3]。目前对于PM对脑缺血再灌注大鼠模型细胞凋亡的影响研究甚少，因此本次研究就此问题进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组：选取健康成年雄性SD大鼠75只，体重约220～250 g。将大鼠随机分为假手术组、模型组、PM低剂量组、PM中剂量组、PM高剂量组五组，各组15只大鼠。PM低剂量组于术后给于5 mg/kg腹腔注射Purmorphamin溶液，PM中剂量组于术后给予10 mg/kg腹腔注射Purmorphamine溶液，PM高剂量组给予20 mg/kg腹腔注射Purmorphamin溶液。模型组及假手术组给予DMSO溶液腹腔注射。

1.1.2 材料：Purmorphamine粉剂购于上海凯试公司，DMSO购自美国Sigma公司，D-140图像记录分析系统(大连竞迈仪器有限公司)、微型离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)、抗Bcl-2抗体Santacruz、Sc23960GAPDH抗体、ABCAMAb8245抗Bax抗体Santacruz、ECL试剂盒购于北京中山、0412-31二抗(Zymed公司)、SK-30高速冷冻离心机购于美国SIGMA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备及给药：采用Longa等[4]改良的线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型。大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，备皮消毒后切开颈部皮肤，钝性分离周围组织，暴露并分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉，动脉夹暂时夹闭颈内动脉及颈总动脉。在距离颈总动脉分叉处0.4 cm处剪出小口，插入制备好的线栓，松开动脉夹，使线栓进入颅内，插入深度约17～19 cm保证大脑中动脉血流被阻断。固定线栓，2 min后拔出线栓缝合皮肤。假手术组仅分离颈总动脉及分支，并不给予其余处理。PM低剂量组、PM中剂量组、PM高剂量组分别按既定的5、10、20 mg/kg的剂量给予腹腔注射配备好的Purmorphamine溶液，假手术组及模型组给予同等剂量的DMSO溶液腹腔注射。术后大鼠保温苏醒后单笼饲养，室温保持在20～30 ℃。

1.2.2 神经功能缺损评分：大鼠清醒后采用Longa[4]5分制作为评分标准。0分：完全无神经缺损症状。1分：轻度运动障碍，右前爪曲屈状态。2分：中度运动障碍，行走时右转弯。3分：行走向右倾倒无法保持平衡。4分：出现意识障碍。其中1～3分视为造模成功纳入实验分组。

1.2.3 TTC测大脑梗死面积：各组大鼠随机选取5只麻醉后断头取出脑组织，将脑组织放在-20 ℃冰箱内冰冻20 min。取出脑组织沿冠状面切成约2 mm的切片，并将切片放置于2% TTC的PBS缓冲液中于37 ℃避光培养30 min，取出切片4%甲醛溶液固定，脑梗死组呈红色，正常脑组织呈白色，采用图像分析系统测定梗死脑组织面积，并计算脑梗死体积比值。

1.2.4 采用原位TUNEL方法检测脑缺血区细胞凋亡情况：根据TUNEL试剂盒说明书进行操作，切片经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇水合，蛋白酶K溶液去除组织蛋白，PBS漂洗后样本中加入TUNEL反应液50 μl，37 ℃下反应50 min，PBS漂洗后加入DAB显色液50 μl，随后苏木精复染，脱水、透明、封片。光镜下随机选取五个视野观察凋亡细胞素，其中细胞核呈浓缩棕黄色颗粒为凋亡阳性细胞，多见于梗死脑组织周围，取平均值计算阳性细胞数。凋亡率=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.2.5 Western blot 分析Bcl、Bax的表达：组织剪切成小块，加入蛋白裂解液进行裂解。14000 g离心5 min，取上清。5%浓缩、10%分离胶溶液的制备和灌注、将样品稀释到相同的浓度，体积为20 μl，加入4 μl上样缓冲液，混匀后在沸水浴中煮沸5 min。泳道中加入8 μl蛋白质Marker，在其余泳道中把样品全部加入到泳道中。稳压80 V，当溴酚蓝指示剂迁移到浓缩胶与分离胶的界面时，调整电压到100 V，稳压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移到分离胶下缘时，停止电泳，转膜、封闭。将一抗按1∶1000稀释，4 ℃摇床低速摇动过夜孵育。洗脱缓冲液洗涤3次，时间分别为15、10、5 min。第二抗体为羊抗兔，按1∶4000稀释，置于37 ℃恒温摇床上，低速摇动孵育45 min。洗脱缓冲液洗涤3次，每次5 min。在暗室中，滴加1×显影液和定影液分别倒入瓷盘中，定影5～10 min，至胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液，室温晾干。拍照备用。胶片扫描后用Bandscan 5.0软件进行灰度分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经缺损评估及脑梗死体积比较 模型组大鼠神经功能缺损评分与假手术组相比较明显升高，梗死体积比明显增大(P<0.05)。药物组(PM低剂量组、PM中剂量组、PM高剂量组)与模型组相比较神经功能缺损评分明显降低，脑梗死体积比明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评估及脑梗死体积比较

2.2 各组细胞凋亡率比较 模型组大鼠脑细胞凋亡率与假手术组相比较明显升高(P<0.01)，药物组脑细胞凋亡率与模型组凋亡率明显下降，其中PM高剂量组凋亡率下降最为显著(P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞凋亡率比较(%)

2.3 各组Western blot检测Bcl-2、Bax的表达 假手术组可见极少量蛋白表达。模型组与假手术组相比较，Bcl-2蛋白的表达明显增多，差异具有统计学意义(P<0.05)。给药组与模型组相比较，Bcl-2表达明显增多，其中PM高剂量组的增多最为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。Bax蛋白表达在假手术组中少见，模型组与假手术组相比较Bax蛋白表达明显增多，差异具有统计学意义。PM低剂量组、PM中剂量组、PM高剂量组较模型组相比较Bax的表达明显下降，其中PM高剂量组Bax表达下降最为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

表3 各组Bcl-2、Bax的表达

图1 Western Blot检测Bcl-2、Bax的表达

3 讨 论

脑缺血再灌注是一个涉及到钙超载、炎症反应，细胞凋亡、自由基损伤等一系列复杂的级联反应，细胞凋亡是其中一个极其重要的病理生理机制[5-6]。细胞凋亡是细胞程序化、自主化死亡的复杂过程，该过程由多种调节基因共同调控完成。某些生理或病理因素诱导下激活膜信号系统，启动有关调控细胞凋亡的程序基因，最终导致细胞按一定程度控制自我破坏和死亡[7]。在众多调控基因中Bcl家族基因家族在细胞凋亡中发挥着重要的作用。Bcl-2蛋白和Bax蛋白是目前Bcl家族中研究比较广泛深入的基因。促凋基因Bax和抑凋基因Bcl-2家族具有同源性[8]，Bcl-2 蛋白和Bax蛋白是线粒体外膜上一对相互拮抗的细胞凋亡因子，有研究表明Bcl-2蛋白和Bax蛋白是抑制和促进细胞凋亡的最重要基因[9-10]。Bcl-2蛋白是一种抗凋亡蛋白，可以通过抑制Bax蛋白的转位，保护线粒体电势梯度，调节钙离子的自稳状态，抑制氧自由基的产生，从而抑制凋亡途径[11]。因此Bcl-2蛋白常作为对细胞凋亡进行研究的观察指标。Bax蛋白是一种促凋亡蛋白，不但起到拮抗Bax蛋白的作用，而且有直接促进细胞凋亡的作用。Bcl蛋白和Bax蛋白之间的平衡影响细胞凋亡的发生。因此本次研究选取Bcl蛋白和Bax蛋白作为观察细胞凋亡的指标，以探究 Purmorphamine在对脑缺血再灌注细胞凋亡的影响。

Purmorphamine是一种分子量为520.62的小分子嘌呤衍生物，可与SHH信号通路中SMO蛋白结合从而激活SHH信号通路[ 12]。Purmorphamine与脑缺血性疾病关系密切[13]。Purmorphamine可以激活SHH信号通路促进脑缺血大鼠的血管再生，也可促进脑缺血神经元修复。Chechneva[14]研究表明Purmorphamine在脑缺血中可使血脑屏障通透性下降以及受损神经元组织型纤溶酶原激活物短暂上调，从而发挥神经保护作用。此外，Purmorphamine可以提高海马神经元抵抗能力，通过抗氧化来保护海马神经元，从而减少神经元死亡[15]。在本次研究中，我们发现Purmorphamine可以减轻脑缺血再灌注后的脑梗死面积，同时可以抑制神经细胞的凋亡。

本研究显示在大鼠脑缺血再灌注模型组6 h后Bax较假手术组明显上调，而Bcl-2较假手术组明显下降，这提示Bax和Bcl-2参与脑缺血再灌注后细胞凋亡的调控，这与之前研究相符合。而PM组与模型组相比较，Bax的表达下调，Bcl-2的表达明显上调，这表明Purmorphamine可以通过抑制Bax的表达，上调Bcl-2的表达，从而抑制细胞凋亡，减轻脑缺血后脑损伤。PM高剂量组与其他剂量组相比较，对Bax的表达下调及Bcl-2表达上调的作用更为显著。这表明Purmorphamine对细胞凋亡的影响与剂量呈正相关。本研究仍有大量不足。对于Purmorphamine调控Bax和Bcl-的表达的具体机制，是否与SHH信号通路被激活有关等相关问题仍需进一步深入研究。