AMP激活蛋白激酶对慢性心力衰竭进展影响的实验研究

金爱萍，李 蔚，李 冰，张倩榕

(西安交通大学第二附属医院老年心血管科，陕西 西安710004)

AMP激活蛋白激酶(Mammalian AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包含催化α亚单位和调节β和γ亚单位[1]。AMPK对心脏肥大和心力衰竭具有保护作用，可通过阻断各种信号通路，包括活化T细胞核因子(Activated T cells nuclear factor，NFAT)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)、叉头转录因子(Forkhead box O，FOXO)和肌肉特异性环指蛋白1(Muscle specific ring finger protein 1，MuRF1)的核因子减轻由压力超负荷或去氧肾上腺素(Phenylephrine，PE)引起心脏肥大[2]。已有研究显示[3]，抑制自噬反应和钙离子/钙调素依赖激酶β-(CAMKK-β)-AMPK信号通路活性能够延缓心脏肥大进程；激活AMPK有助于提高心肌细胞肥大代偿能力、改善心肌缺血缺氧状态。此外AMPK诱导自噬反应能够干扰心脏肥大进程，阻止心力衰竭病情发展；但自噬调节异常亦可能是导致心力衰竭发生发展。目前对于AMPK能否通过调节自噬来达到保护心力衰竭患者心脏功能作用尚存在争议[4]。本次研究通过探讨AMPK激活对慢性心力衰竭病情的影响及作用机制，旨在寻找潜在有效治疗靶点，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 GAPDH、Beclin-1、Pho核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)(T389)、P70S6K、Pho-4E结合蛋白1(4EBP1)(T37/46)、4EBP1、Pho-AKT(Ser308)、Pho-AKT(Ser473)及AKT均由Cell Signaling Technology公司提供；Lc3b由Novus公司提供；α肌动蛋白和P62由Sigma公司提供；Ampk激动剂(AICAR)由Toronto chemicals公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物、造模及给药方法：选择8～10周龄雄性C57BL/6J小鼠共40只，体重24～26 g，均由我校实验动物中心提供；小鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉后行主动脉缩窄术，4周后建立心力衰竭模型；其中A组为生理盐水(NS)注射+假手术(sham)，B组为AICAR注射+假手术(sham)，C组为NS注射+行主动脉缩窄手术，D组为AICAR注射+行主动脉缩窄手术。

1.2.2 超声心动图检查：检查前小鼠吸入1.5%～2%异氟醚；采用Visual Sonics公司生产Vevo 2000型动物专用超声诊断仪，探头频率为30 MHz；小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹耦合剂，选取左心室乳头肌短轴切面测量。

1.2.3 组织取材测量：称量小鼠体重并记录，颈椎脱臼法迅速处死小鼠，沿胸骨正中向颈部剪开皮肤及横隔，充分暴露心脏和肺脏；剪下心脏后轻轻挤压心腔内血液，修剪心脏周围多余部分，记录心脏重量。取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度；计算心重量与体重的比值(HW/BW)，肺重量与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。

1.2.4 Western blotting检测：采用细胞溶解缓冲液+PMSF+蛋白酶抑制剂混合液提取左心室组织蛋白质；蛋白浓度检测采用Bio-Rad 蛋白分析试剂盒；Western blotting操作完成后通过Quality One软件完成定量分析。

1.2.5 荧光共焦显微镜检查：制备心脏组织冰冻切片(厚度5 mm)，干燥后采用PBS洗涤并在过氧化氢(0.3%)溶液中孵育30 min；制备样品在室温下以BSA(10%)封闭1 h，一抗孵育，再采用荧光二抗洗涤孵育；采用Zeiss LSM 600型共聚焦显微镜系统成像。

1.2.6 透射电子显微镜检查：制备1～2 mm3组织块，浸泡于2%多聚甲醛和2.5%戊二醛4 h以上，1%OsO4中固定1 h；采用超显微切片机将组织制备成60～80 nm切片，放置于透射电镜网格并行柠檬酸铅染色，80 kV电压下采用FEI公司双透射电子显微镜成像。

2 结 果

2.1 两组心脏功能相关实验指标比较 C组HW/BW、LW/BW、HW/TL、肺重量/胫骨长度比(LW/TL)、左心室舒张末期内径(LVEDd)及左心室收缩末期内径(LVESd)水平均显著高于A、B组(P<0.05)；C组射血分数(Ejection fraction，EF)水平显著低于A、B组(P<0.05)；D组HW/BW、LW/BW、HW/TL、LW/TL、LVEDd及LVESd水平均显著高于A、B组，但低于C组(P<0.05)；D组EF水平显著低于A、B组，但高于C组(P<0.05)。见表1。

2.2 AMPK对心力衰竭模型动物mTOR信号通路的影响 B组术后4EBP1、P70S6K及AKT磷酸化水平显著高于A组(P<0.05)；D组术后4EBP1、P70S6K及AKT(Thr308)磷酸化水平显著低于C组(P<0.05)；D组术后AKT(Ser473)磷酸化水平显著高于C组(P<0.05)。

2.3 AMPK对于慢性心力衰竭患者自噬的抑制作用 D组术后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ/GAPDH比值显著低于C组，P62表达显著高于C组(P<0.05)；C组和D组Beclin-1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组和D组心脏LC3b蛋白表达量显著高于A组、B组(P<0.05)；D组心脏LC3b蛋白表达量显著低于C组(P<0.05)；同时B组心脏LC3b蛋白表达量显著高于A组(P<0.05)，见图1。

表1 两组心脏功能相关实验指标比较

图1 AICAR给药后心脏自噬现象(荧光染色，×200倍)

3 讨 论

自噬反应是维持心肌形态及心脏功能重要组成部分之一；已有研究显示[5]，脂联素可刺激自噬反应，抑制心肌细胞肥大，从而改善心脏功能；同时激活Sirt3可在调节自噬反应同时改善心肌肥大病情。但亦有报道认为[6-7]，心力衰竭和过度活跃自噬反应密切相关。早期实验研究证实[8]，AMPK可通过激活自噬有效抑制心脏肥大发生，但对于自噬反应过度激活及调节紊乱亦可加速心力衰竭病情发展。基于以上数据，本次研究目的在于探索AMPK是否可通过调节自噬作用达到改善心力衰竭病情作用。

以往实验研究证实[9]，心脏肥大时AMPK被激活并能够延缓心力衰竭病情进展，提示AMPK在心力衰竭病变发生前即已开始诱导自噬反应。同时在以往建模过程中往往行主动脉缩窄手术4周后完成慢性心力衰竭模型建立，再于心力衰竭阶段给予AICAR给药，此时自噬反应已被过度激活[10]。而本次研究结果中，AMPK可通过下调自噬反应来促进心力衰竭模型动物心脏功能恢复；同时AMPK增强行假手术组模型动物自噬反应，但心脏功能仍正常。笔者推测AMPK可通过上调心肌肥大时自噬反应和下调心力衰竭时过度自噬来达到改善心脏功能的作用。

mTOR包括两个功能不同复合物，即mTORC1和mTORC2；其中mTORC1由mTORC、Raptor、Mlst8及Pras40组成，具有调节蛋白质合成、细胞增殖、代谢及自噬等多方面作用；而mTORC2则由mTORC、Rictor、Mlst8、Protor(prr5)及Sin1组成，主要用于控制细胞存活及调节极性[11-12]。已有研究显示[13]，损伤组织细胞往往失去增殖潜能和蛋白沉积调节作用，细胞内积聚大量毒性碎片，破坏正常细胞代谢进程，最终诱导蛋白毒性应激反应发生。另有研究表明[14-15]，心肌细胞肥大及凋亡可被mTORC1受体显著抑制，可能机制为清除蛋白毒性应激源和高炎症性衰老表型组织细胞。AMPK是mTORC1重要调节因子之一，AMPK-mTORC1通路可参与到心力衰竭自噬及能量代谢调节过程中[16]。本次研究结果中，AMPK可有效抑制衰竭心脏自噬活性，下调mTORC1表达。目前并无特异性mTORC1抑制剂能够在抑制TORC1功能同时不影响其他生理作用，故mTORC1对于心肌肥大影响无法完全归因于其对于自噬反应调节作用[17-18]。此外糖尿病心力衰竭患者中可见mTORC活性下降，但AMPK活性未见明显变化[19]。故笔者认为AMPK激活后mTORC1下调可能未参与到心力衰竭自噬调节过程。

mTORC2对于自噬反应影响仍存在争议；以往研究显示[20]，AMPK通过调节mTORC1相关自噬反应以抑制心脏肥大。但本次研究结果中，AMPK在下调模型动物心脏自噬活性同时激活mTORC2，说明AMPK可通过刺激mTORC2活性以调节过度激活自噬反应，同时Stim1亦可通过抑制mTORC2以加快心力衰竭病情进展；已有研究证实[21]，mTORC2可对心力衰竭模型小鼠心脏收缩功能进行调节；笔者推测通过mTORC2下调自噬反应及AMPK激活可延缓心力衰竭病情进展。

综上所述，慢性心力衰竭患者体内AMPK激活可通过上调mTORC2表达、抑制心脏自噬活性，从而达到有效改善心脏功能的作用。