辛伐他汀联合利塞膦酸钠对地塞米松诱导大鼠骨丢失的作用

郭志斌，吴春芳，张国彬，迟博婧，王玉丹，刘子洪，王宝，马超，田发明∗

(1.开滦总医院林西医院骨外科，河北唐山 063000；2.华北理工大学，医学实验研究中心，河北唐山 063000；3.开滦总医院骨外科，河北唐山 063000)

骨质疏松症的病理特点是骨丢失和微观结构劣变，并由此导致发生骨折的风险增加[1-2]。骨质疏松症病因复杂，荷尔蒙失调、久坐不动的生活方式、营养摄入不足、代谢和慢性炎症疾病，都可以加速骨质疏松症的发展[3]。糖皮质激素主要用于抗炎和治疗自身免疫性疾病，但是长期应用的副作用之一是可能导致骨质减少，骨质疏松症和骨折风险增加[4]。

双膦酸盐类药物，如利塞膦酸盐、阿仑膦酸盐等可通过抑制破骨细胞介导的骨吸收而阻止骨丢失。辛伐他汀是一种3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A还原酶抑制剂，临床上主要作为降脂类药物。目前国内外研究表明，辛伐他汀具有促进成骨细胞分化并抑制破骨细胞的形成，表现出一定的抗骨质疏松潜能[5]。然而上述两种药物联合应用对地塞米松诱导的骨丢失的干预效果尚不明确。本研究拟通过地塞米松皮下注射诱导建立大鼠骨质疏松模型，并给予辛伐他汀和或利塞膦酸钠干预，观察两者单独或联合应用对该模型骨丢失的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只SPF级3月龄雄性SD大鼠，购自北京维通利华实验动物中心【SCXK(京)2017-0001】，体重(246±18)g。所有动物在华北理工大学动物中心屏障环境中饲养【SYXK(冀)2015-0038】。饲养期间大鼠自由进食水，饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在22～25℃。本研究中涉及实验动物的处理和干预，均符合华北理工大学实验动物伦理委员会的相关规定，动物实验伦理审查证明(LX2018136)，并遵照实验动物使用的3R(减少、替代、优化)原则。

1.1.2 主要试剂与仪器

地塞米松(辰欣药业股份有限公司)，辛伐他汀(浙江瑞邦药业有限公司生产)，利塞膦酸钠(北京双鹭药业股份有限公司)，骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)、RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)一抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

微计算机断层扫描(micro-CT，Skyscan，比利时)，AG-IS型万能试验机统(日本岛津公司)，PCR仪(Applied biosystems，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

分为五组，每组8只，A组对照组，B组为模型组，皮下注射地塞米松(2.5 mg，每周 2 次)，C、D、E组在给予地塞米松皮下注射的基础上，每天分别给予辛伐他汀(5 mg/kg)灌胃[6](C组)、利塞膦酸钠(0.1 mg/kg)灌胃[7-8](D组)和联合干预(E组)，8周后处死所有大鼠取材。

1.2.2 股骨骨密度检测

取所有大鼠左侧股骨，采用用Norland-XR 36双能X线骨密度测量仪(DEXA，美国)进行骨密度分析。

1.2.3 Micro-CT分析胫骨近段松质骨微观结构

用Sky Scan 1176Micro-CT系统(电压50 KeV、电流270 μA)对大鼠左侧胫骨进行扫描检测，感兴趣区胫骨近端松质骨生长板下0.5～2 mm。对所有图像分别使用CT Analyzer与 CT vox软件分析和处理。并分析以下参数：骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁数(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、 骨 小 梁 间 距 (trabecular separation，Tb.Sp)。

1.2.4 生物力学检测股骨最大载荷

所有大鼠左侧股骨完成骨密度检测后，进行三点弯曲试验，跨距20 mm，中央垂直施加载荷，速率10 mm/min，在软件里直接得到最大载荷。

1.2.5 免疫组化检测OPG和RANKL蛋白水平的表达

取所有大鼠右侧股骨，常规固定、脱钙后，脱水并用石蜡包埋，制备6 μm的石蜡切片，经烤片、二甲苯透明脱脂、梯度乙醇至纯水水化后，抗原修复，过氧化氢处理后，滴加 OPG、RANK 一抗45 μL，孵育过夜。次日按照PV6000试剂盒滴加二抗并进行后续操作，最终由DAB显色，苏木素复染、盐酸酒精分化及自来水返蓝，中性树胶封片。光学显微镜采图，Image-Pro Plus软件进行积分光密度值分析(integratal optical density，IOD)。

1.2.6 Real time PCR检测OPG和RANKL mRNA水平的表达

取右侧胫骨制备组织匀浆，采用TRIzol法提取RNA，并经反转录合成第一链cDNA后，测定质量和浓度。采用Real time PCR体系扩增目的基因与内参基因(GAPDH)，计算两者相对表达量的比值。PCR反应体系：总体积 50 μL，包括：Real time PCR MasterMix 25 μL，cDNA 模板 5 μL，引物(10 μmol/L)各2 μL。PCR反应条件：OPG和RANKL为同一条件：95℃，5 min；95℃，10 s；69℃，30 s；45 个循环；72℃，5 min。引物序列：GAPDH(扩增产物为bp)的上游引物：5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′，下游引物：5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；OPG 上游引物：5′-GTCCCTTGCCCTGACTACTCT-3′，下游引物：5′-GACATCTTTTGCAAACCGTGT-3′；RANKL 上游引物： 5′-CCCATCGGGTTCCCATAAAGTC-3′， 下 游 引物：5′-GCCTGAAGCAAATGTTGGCGTA-3′。

1.3 统计学分析

实验数据录入Excel表格，采用SPSS 21.0进行统计学分析，采用单因素方差初步分析是否存在组间差异，后续两两比较采用LSD-t检验，实验数据以平均值±标准差()表示，P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 骨密度

骨密度检测结果：双能X线骨密度分析结果如图1所示，A组骨密度最高，显著高于其余四组(P＜0.05)，利塞膦酸钠组显著高于模型组(P＜0.05)，联合治疗组显著高于模型组和单独用药组(P＜0.05)。

2.2 生物力学检测

各组大鼠股骨最大载荷：模型组(90.2±7.1)N显著低于对照组(104.6±10.62)N(P＜0.05)和联合治疗组(101.4±7.7)N。辛伐他汀组(94.7±9.6)N、利塞膦酸钠组(98.5±10.9)N与其他各组比较均无显著性差异(图2)。

2.3 Micro-CT分析

Micro-CT检测胫骨近端松质骨结果如表1所示：骨小梁体积分数：模型组和各治疗组均显著低于对照组(P＜0.05)，联合治疗组显著高于模型组和单独用药组，但仍低于对照组(P＜0.05)。骨小梁数量：模型组和各给药组均显著低于对照组，联合用药组显著高于对照组(P＜0.05)。骨小梁厚度：模型组显著低于对照组，联合用药组显著高于模型组(P＜0.05)，其余各组间比较无显著差异。骨小梁分离度：模型组和各治疗组均显著高于对照组(P＜0.05)，联合治疗组显著低于模型组和单独用药组，但仍高于对照组(P＜0.05)。

2.4 免疫组化检测结果

免疫组化检测OPG在各组右侧股骨松质骨表达的结果：模型组、利塞膦酸钠组、联合用药组均显著低于对照组(P＜0.05)，辛伐他汀组和联合用药组显著高于模型组(P＜0.05)(图3)。

免疫组化检测RANKL在各组右侧股骨松质骨表达的结果：模型组及各用药组RANKL的表达均显著高于对照组(P＜0.05)，联合用药组显著低于模型组(P＜0.05)(图4)。

2.5 Real time PCR检测结果

Real time PCR定量分析OPG mRNA在各组表达结果：B组显著低于 A组、C组显著高于 B组(P＜0.05)，其他组间差异均无统计学意义(P＞0.05)；B组RNAKL mRNA的表达显著高于其他4组(P＜0.05)，C组RNAKL mRNA的表达显著高于A组，其他两两组间比较未见显著差别(P＞0.05)。

图1 骨密度检测结果(x¯±s，n＝8)Note.Compared with group A，aP＜ 0.05.Compared with group B，bP＜ 0.05.Compared with group C，cP＜ 0.05.Compared with group D，dP＜ 0.05.(The same in the following figures and tables)Figure 1 Results of BMD test(x¯±s，n＝8)

图2 骨密度检测结果(，n＝8)Figure 2 Results of BMD test(，n＝8)

表1 Micro-CT分析结果(，n＝8)Table 1 Results of Micro-CT test(，n＝8)

表1 Micro-CT分析结果(，n＝8)Table 1 Results of Micro-CT test(，n＝8)

组别Groups骨体积比Bone volume/total volume骨小梁数量Trabecular number骨小梁厚度Trabecular thickness骨小梁分离度Trabecular separation A组Group A 29.5±2.7 2.9±0.3 101.6±4.9 231.4±63.8 B组Group B 20.1±2.1a 2.3±0.2a 93.3±4.6a 394.1±41.3a C组Group C 21.6±2.8a 2.4±0.1a 98.8±8.0 356.1±36.4a D组Group D 21.9±2.6a 2.5±0.1a 98.9±7.5 354.9±33.7a E组Group E 25.3±2.9abcd 2.6±0.2ab 103.7±6.4b 294.9±49.6abcd

图3 免疫组化检测各组OPG的表达(，n＝8)Figure 3 Immunohistochemistry staining and IOD analysis of OPG(，n＝8)

图4 免疫组化检测各组RANKL的表达(，n＝8)Figure 4 Immunohistochemistry staining and IOD analysis of RANKL(，n＝8)

图5 PCR检测结果(，n＝8)Figure 5 Results of PCR analysis(，n＝8)

3 讨论

3.1 地塞米松诱发大鼠骨质疏松模型

本研究证实，在大鼠皮下注射地塞米松8周后，诱发大量骨丢失、微结构退化、生物力学性能下降，这也与先前的研究结果一致。研究表明，地塞米松通过抑制成骨细胞细胞增殖及细胞外基质合成降低成骨能力[9]。此外，地塞米松促进破骨细胞的增殖[10]。长期接受地塞米松治疗的患者在诱发骨丢失的同时，还存在易于发生骨折的风险[11-12]。我们通过对骨保护素和破骨细胞分化因子的蛋白和mRNA水平的比较分析发现，地塞米松可以抑制骨保护素的表达，且同时刺激破骨细胞分化因子的表达，这些结果提示地塞米松诱发大鼠骨丢失的作用机制与抑制成骨细胞功能同时促进破骨细胞活性有关。

3.2 辛伐他汀联合利塞膦酸钠抗骨质疏松效果优于单独用药

辛伐他汀作为同类药物中应用较多的一种，除了降脂作用，其对骨代谢的影响也日益受到关注，且部分前期实验已经证实其促进骨形成或抑制骨吸收的潜能[6，13-14]，如辛伐他汀可以激活 TGF-β/smad3信号通路拮抗地塞米松诱导的破骨细胞凋亡[15]，其抗破骨作用还与诱导OPG的表达并抑制RANKL的表达有关[16]。然而，在本研究中，辛伐他汀对于糖皮质激素诱发的大鼠骨丢失的干预效果并不显著，未能达到预期，虽然通过对OPG、RANKL免疫组化和PCR的检测提示辛伐他汀具有刺激OPG并抑制RANKL表达的作用，但在组织学和生物力学水平的分析结果提示其作用不能阻止该模型的骨丢失。与之相对应的，利塞膦酸钠对该模型骨丢失的作用则较为显著，表现出比辛伐他汀更强的抑制骨丢失的作用，具体表现为，辛伐他汀单独用药骨密度虽然具有高于模型组大鼠的趋势，但差异并不显著；而利塞膦酸钠组大鼠的骨密度则显著高于模型组大鼠。通过进一步分析联合用药的效果，我们发现联合用药组大鼠骨密度不仅高于模型组大鼠，也显著高于两组单独用药的大鼠，提示联合用药较之单独用药抗骨质疏松的作用更强。然而，通过与正常对照组大鼠比较，我们发现，无论单独用药还是联合用药骨密度都未能恢复到正常值。此外，本研究的辛伐他汀和利塞膦酸钠药物剂量参考以往类似研究[6-8]，药物剂量在安全范围，但并未观察联合用药是否增加毒副作用，在今后的研究中应予以重视。

除骨密度外，我们进一步分析了各组大鼠股骨的最大载荷，也进一步证实了单独用药效果不及联合用药，结果发现只有联合用药组大鼠股骨的最大载荷显著高于模型组，而单独用药组与模型组比较，虽有升高趋势，但差别并不显著。相比较而言，利塞膦酸钠组较辛伐他汀最大载荷数值表现出更高的趋势。我们通过micro-CT分析对松质骨微结构参数的比较发现，联合用药组较单独用药组表现出更高的骨量、骨小梁数量，更低的骨小梁分离度，提示联合用药较单独用药对于保持骨量和微观结构具有更显著的作用。

3.3 不足与展望

此外，与辛伐他汀和利塞膦酸钠单独干预相比，联合用药组在组织学和分子水平的作用都更强。利塞膦酸钠作为第三代双膦酸盐类药物，目前仍是治疗骨质疏松的首选药物之一[17-19]。因为其作用机制主要是抑制破骨细胞的功能活性，对骨形成的影响甚微，因此为提高其应用效果和扩大适用范围，目前多项研究探讨了其与其它性质药物的联合应用对骨代谢的影响，包括分别与甲状旁腺激素1-34[20]和维生素K[21]的联合应用，其中与甲状旁腺激素1-34联合或序贯应用效果较单独应用更佳，但对后者而言，与维生素K的联合应用并未表现出优于利塞膦酸钠单独用药。因此，本研究虽然初步证实辛伐他汀与利塞膦酸钠联合应用能更好的治疗激素诱发的大鼠骨丢失，但并未能完全抑制其进程，是否能通过调整剂量和作用周期，或者改变干预方案如序贯治疗等进一步增强联合使用的疗效，这些都有待进一步研究证实。