子宫内膜异位症小鼠模型研究进展

孟鑫，陈景伟

(河北中医学院中西医结合学院，中西医结合研究所，河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室，石家庄 050200)

EMs是一种常见的妇科疾病，以盆腔疼痛、不孕、盆腔包块为主要临床表现[1]。迄今为止，该病的发病机制尚未明确，其临床药物疗效和手术治疗效果也欠佳，由于伦理道德等多方面现实原因的限制，在人体进行其发病机制和治疗方法的各项研究存在一定的局限性。动物实验为研究EMs提供了极大便利，逐渐成为了研究该病的重要手段。目前，已经成功建立了非人灵长类、家兔、鼠类及鸡胚绒毛尿囊膜等的EMs动物模型[2]。本文将从各类小鼠的造模方法、模型评价等方面作出较为综合的阐述及比较，以便研究者可以据此选择更贴合实验的造模方法。

1 发病机制

目前为止，国内外较为公认的发病机制有经血逆流学说、化生学说、转移学说、新生儿宫血学说[3]。经血逆流学说认为有活性的子宫内膜组织碎片经输卵管逆行至腹腔，并种植生长于盆腹腔或卵巢等其他组织上。该学说目前最为广泛接受，但依然不能完全解释EMs的发病原因，因此，在此基础上，郎景和[4]提出了“在位内膜决定论”，认为个体在位子宫内膜的生物学特性是其能否种植生长在其他部位的决定因素。化生学说认为异位子宫内膜细胞来自于其他组织的化生；转移学说认为组织碎片是经血管或淋巴管转移至其他部位并种植生长；新生儿宫血学说提出母体激素在新生儿出生后的减少导致了子宫出血，部分子宫出血逆流到腹腔，其中可能含有干细胞[5]。除此之外，中医认为瘀血是EMs的基本病因病机，瘀血阻滞，气血运行不畅是导致EMs的基本病因[1]。尽管各学说众说纷纭，但其发病机制依然不明确，因此，选择合理的动物模型就成为了研究其发病机制的首要任务。

2 动物的选择

目前的动物造模方法都基于经血逆流学说，主要包括自发性、诱发性(自体移植)和种植性(异体移植)三种[6]。自发性主要应用于非人灵长类动物[7]，如猕猴、狒狒和带尾纤猕猴，因其具有类似于人类的盆腔解剖结构和有规律的月经周期，可以自发形成EMs，是研究EMs发病机制及治疗的理想方案。但因为灵长类动物价格昂贵，自发性造模成功率低，周期长等原因无法普及。诱发性主要适用于兔、鼠等啮齿类动物，种植性则多见于裸小鼠、SCID小鼠等。但因为啮齿类动物与人类之间有种属差异性，其实验结果可能与临床存在一定偏差。

在众多动物中，啮齿类动物中的小鼠因其价格便宜，体型娇小，饲养管理方便，生长繁殖速度快，并且已经培育出了大量的近交系、突变系和封闭群，成为了EMs研究的主要选择，不仅可以用于EMs发病机制的研究，还可用于研究药物对EMs的影响作用，为EMs的实验研究作出了巨大贡献。

3 造模方法及小鼠的选择

3.1 术前处理

使实验小鼠处于统一的动情周期，常用的方法为连续阴道涂片法[8]和直接给予外源性雌激素法[9](灌胃或肌注戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、乙烯雌酚等)，但在操作过程中发现使大量的实验动物都处于统一的动情周期无疑加大了实验的难度与耗损。张薇等[10]分别选择在SD大鼠的动情期和非动情期进行自体移植术以建立EMs模型，发现非动情期和动情期的造模率及异位灶体积无显著差异。陈琼华等[11]通过建立BALB/C小鼠EMs模型并观察同样发现小鼠的造模成功率与其所处的动情周期无关。这一结果在简化造模实验、节约时长、节省资源等方面均具有重要意义。

3.2 造模方法

EMs小鼠的造模方法主要包括自体移植、同种异体移植和异体移植。

3.2.1 自体移植

即手术缝合法[12]，选取尿道口上方2 cm处沿腹部正中线纵行切开，找到左侧子宫，于近卵巢端结扎子宫两端，剪下中间段，剪除其他多余组织血管后纵行剪开，将其内膜面贴于小鼠腹腔壁上，并将子宫对角缝合固定，完成后关腹并进行后续操作。王智超[13]通过分别移植到小鼠腹壁内侧、大网膜及肠壁三个部位来比较异位灶种植成功率，最终结果表明三者的种植率无明显差异，研究者可根据各自的研究目的选择最佳的种植部位。

3.2.2 同种异体移植

即腹腔注射法[14]，将小鼠分为供体组和受体组，将供体小鼠脱颈处死，剖开腹部，取出子宫，除去其多余组织后沿Y型子宫正中线剪开，分别放入生理盐水中，纵行切开暴露出子宫内膜后，用眼科剪将其剪碎至1 mm3大小的小碎片。取受体小鼠，用16号针头注射器将含有子宫碎片的1 mL生理盐水注射至受体小鼠腹腔内，进针点选取受体小鼠的小腹部偏腹中线0.5 cm处的左下腹，一只供体小鼠子宫平分给两只受体小鼠。关于注射量，徐建波[15]进行了阶梯性注射实验，分别向受体小鼠注射1、2、4、8、16、32 片 1 mm2大小的子宫内膜碎片观察，结果表明异位灶的成活率与注射量呈一定的曲线关系，当注射量≥4片时，注射量与成活率无显著关系。

3.2.3 异体移植

异体移植是指将人子宫内膜组织植入到动物体内加以研究观察，由于裸鼠和SCID小鼠属于免疫缺陷小鼠，不会发生异体移植的免疫排斥反应，种植的成功率较高，被作为异体移植的首选。其造模方法包括腹腔种植法、腹腔注射法和皮下种植法。

腹腔种植法[16]：将新鲜的人子宫内膜组织标本置入含DMEM培养液的培养皿中，后用冷的0.1 mol/L的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3～4次，于无菌培养皿中将组织剪至2 mm×3 mm大小的碎块，分为每组约8～10个小碎块，分别放入PBS中。取麻醉后的裸鼠于下腹正中横切约1 cm的切口，将处理好的一组碎块随机放置盆腹腔内的不同位置后，逐层关腹。

腹腔注射法[17]：人子宫内膜组织的准备清洗同上，将组织剪至0.5～1 mm2大小的碎片，平均分至PBS中。选取SCID小鼠下腹正中部位为进针点行腹腔穿刺，用16号针头注入含有组织碎片的PBS液0.2 mL后，按压片刻，防止液体流出。

皮下种植法[18]：将准备好的人子宫内膜组织用无菌PBS清洗3～4次，剪至1 mm2大小的碎片，平均放置于含有DMEM培养液的培养皿中混匀。用9号针头将含有内膜组织碎片的培养液按每只0.5 mL注入，裸鼠可选取背部皮下方便后续观察，SCID小鼠则选取下腹部皮下，以腹部中线脐下为进针点。

3.3 各造模方法优缺点比较

EMs动物模型对研究其发病机制及临床治疗具有重大价值，其造模方法逐渐实现了由自发到诱发，有创到无创的进化，尽管如此，现有的造模方法仍然都存有各自的不足之处，因此，以实验目的和可行性作为选择条件，综合权衡各种模型方法的利弊，才能充分发挥不同造模方法的优势。常用的几种建立小鼠EMs模型方法的优缺点比较见表1。

3.4 小鼠的选择

随着实验小鼠培育技术的提升，小鼠的品种逐渐丰富，更大地满足了实验的需求，结合实验目的、操作技术及环境因素选择最佳的实验小鼠，可以进一步提高造模的成功率及实验的准确性。目前，用于建立EMs模型的小鼠品种，优缺点及各自适用的造模方法详见表2。

4 模型评价

4.1 模型建立成功标准

肉眼可以观察到异位灶体积增大，呈透明囊状，内有黄色液体，异位灶表面可看到新生的细小血管。显微镜下可见异位灶中含有子宫内膜腺体和间质细胞，囊液内和间质层可见到炎症细胞[19]。

4.2 观察指标及方法

4.2.1 大体观察

肉眼观察小鼠的精神状态，毛色质量，饮食情况及活动变化；采用皮下种植法时要观察皮下异位灶结节的大小，生长情况。处死开腹探查时，观察异位灶生成情况，形态，位置，有无粘连等，并用双脚规测量异位灶体积大小。

4.2.2 组织学观察

取异位灶进行HE染色镜下观察及免疫组化观察，可直接观察异位灶组织细胞形态，为EMs的发展、恶化提供了病理学依据。

4.2.3 影像学观察

影像学观察包括MRI、超声等都在EMs动物模型研究中有所应用，影像学检查可以通过图像来直观的获取所需信息，并可直接进行数据分析，有效地避免了动物死亡，减少了动物的应激反应。但该方法因其价格昂贵，在实验中未得到广泛普及。

表1 建立EMs小鼠模型方法优缺点比较Table 1 Advantages and disadvantages of the mouse model of EMs

表2 实验常用小鼠的优缺点及适用造模方法Table 2 Advantages and disadvantages of mouse and the applicable modeling are commonly used in experiments

4.2.4 荧光染色法观察

荧光染色是一种活体成像技术，可应用慢病毒载体将荧光素酶和红色荧光蛋白基因转入内膜组织并注入裸鼠体内，利用活体成像仪来实时监测造模情况及疾病进展情况[20]。该方法不仅实现了无创监测，而且定位更加准确，最大限度地避免动物死亡所带来的实验耗损，具有很高的优越性。

4.3 造模周期

关于小鼠EMs造模的最佳周期，现阶段国内外的研究结果各不统一，不同的研究者选择的时间也不尽相同。徐建波[15]通过建立C57BL/6小鼠EMs模型研究，表明异位灶的重量在第5天趋于稳定，大小在第9天也达到稳定，故提示第9天可能为最佳观察时间。陈琼华等[11]从异位灶大小、分布及BALB/C小鼠的体重方面研究发现第4天与第21天无明显差异，提示第4天便是最佳观察时间。王智超[13]研究KM小鼠造模时间表明在术后第2周模型既已建立成功，但异位灶体积在第4周处于最大。任旭等[18]通过研究SCID小鼠造模发现模型在术后第2周已成功，且第2周与第4周异位灶体积无明显差异，但于第6周出现异位灶体积缩小现象。综上所述，目前小鼠异位灶模型的最佳造模周期并不统一，研究过程中观察指标只有异位灶体积及重量，不能全面地反应模型的生长情况。由此可见，EMs造模的最佳周期，以及其时间是否与小鼠种类不同而存在差异性等问题仍然需要进一步深入研究。

5 模型的发展与优化

5.1 EMs合并症模型的建立

EMs作为一个复杂的妇科疾病，其机理，症状表现涉及多个方面，主要症状表现为不孕，疼痛；其病变过程还包括炎症，纤维化等多方面的共同作用。现阶段的动物模型是否可以用于某一方面的深入研究，需要我们在此基础上进一步评价与发展。

EMs不孕模型：崔阳阳等[21]采用“腹腔 +皮下”注射法建立EMs小鼠模型并通过生育功能检测，证实了模型小鼠的生殖能力较正常小鼠低下。王汝倩等[22]采用了供体小鼠模拟经期内膜的方法，以腹腔注射法建立EMs小鼠模型后，再以2∶1的机率与雄鼠合笼，得到不孕小鼠，成功建立EMs不孕小鼠模型。

EMs疼痛模型：陈景伟等[12]采用自体移植法成功复制小鼠EMs模型，于术后连续灌胃补佳乐12 d后，腹腔注射缩宫素，通过观察其小鼠的扭体反应建立了EMs痛经模型，为EMs疼痛的研究提供了理想的动物模型。

EMs纤维化模型：锁漉萱等[23]采用腹腔注射法成功复制EMs小鼠模型后，用Masson染色法分别检测小鼠造模后第7、14、21天的异位病灶和在位内膜纤维化程度，发现于造模后第14天纤维化面积比率达到最佳。路攀等[16]用腹腔种植法复制人EMs裸鼠模型并观察后，同样于造模后第14天发现难以分离的致密粘连，可见EMs小鼠模型建立后14 d即可作为研究EMs纤维化机制的可靠动物模型。

5.2 中医病证结合模型的建立

辨证论治是中医理论体系重要的组成部分，为了更好的从中医传统理论角度认识EMs的发病机制及探究中医药治疗EMs的作用机理，单纯的EMs动物模型已不能满足实验需要，因此，开展中医病证结合EMs动物模型的研究势在必行。

气滞血瘀型EMs模型：王哲等[24]在自体移植的造模术后1周采用了：(1)肾上腺素皮下注射；(2)食用油灌胃；(3)在夹子上贴附纱布并夹小鼠尾部，每次 5 min；(4)45°倾斜鼠笼 2 h；(5)束缚大鼠，限制其自由2 h；(6)冰水浴5 min；(7)禁食水1 d；(8)昼夜颠倒1 d。每天随机选择以上3种方法干预并观察两周，成功用药物加情志刺激干预方法建立了气滞血瘀的EMs模型，实验动物出现精神活跃，脾气暴躁，易激惹等气滞症状，血清CA125值升高，提示造模成功。镜下观察可见异位灶内膜上皮细胞扁平，积层较薄，结构不清的组织病理学改变。

寒凝血瘀型EMs模型：孙博等[25]在自体移植术1周后，将其置于0～1℃冰水混合物中浸泡20 min，连续2周成功建立了寒凝血瘀小鼠模型。周世卿等[26]则采用盐酸肾上腺素皮下注射加冰水浸泡的方法成功建立了寒凝血瘀的裸鼠模型。实验动物出现精神萎靡，反应迟钝，易扎堆等寒邪致病症状，耳唇、爪甲、尾部暗淡，舌质紫暗，舌下脉络增粗等血瘀症状，结合血液流变学和凝血功能指标的变化提示造模成功。镜下观察可见异位灶内膜上皮细胞呈柱状排列，偶有假复层结构，上皮细胞层较薄，间质细胞明显增多，腺体数量增多，腺上皮呈立方排列，且血管丰富。

肾阳虚血瘀型EMs模型：贾云波等[27]先在大鼠笼中放入一定量的冰水，置于4℃冰箱20 min，每天2次，1个月后行自体移植术，术后再次重复术前的冷冻行为成功建立了虚寒型EMs模型。实验动物出现体温降低，动情周期紊乱，反应迟钝，倦缩懒动，大便溏等虚寒症状，结合脏器指数、激素水平均降低的结果提示造模成功。镜下观察可见异位内膜较厚，腺体不明显，管腔消失，炎症细胞增多，细胞排列不整齐[28]。

以上三个证型目前已有发展，但依然有许多中医理论和问题无法在实验中体现，此外，还有湿热、痰瘀等等中医表现暂不能实现，EMs的中医病证结合模型仍需进一步研究发展与完善。

5.3 特殊动物模型的建立与应用

5.3.1 基因敲除小鼠EMs模型的建立

通过基因敲除技术建立转基因动物模型近年来也逐渐在EMs研究过程中备受关注，基因敲除技术是利用一定的生物手段，允许特定的目的基因缺失或失活，对敲除的基因进行有效的控制，从而排除其他因素对实验结果的干扰，使实验结果变得更加可靠和直观[29]。基因敲除小鼠技术是指通过基因工程的办法使小鼠体内某种基因功能缺失的生物技术[30]。宫庭钰等[31]应用雌激素受体β基因敲除小鼠结合自体移植法建立了EMs模型；Burns等[32]分别用IL-6基因敲除小鼠和ER基因敲除小鼠结合腹腔注射法成功构建了EMs模型。应用基因敲除小鼠建立EMs模型，有利于了解已知基因在EMs形成过程中的作用及与相关因子之间的关系，为明确EMs发生发展的影响因素提供科学的实验数据，为临床合理选择有效的治疗药物提供靶向依据。

5.3.2 毒物暴露动物模型的建立及应用

EMs是一种多因素复杂的疾病，受到多种因素的互相影响与调控，根据近年来相关的流行病学调查和实验依据发现，暴露于具有内分泌干扰作用的环境毒物之下可能在其发病机制中发挥了一定的作用[33]，因此建立可靠的EMs毒物暴露动物模型是获得准确研究结果的首要条件。崔照领等[34]采用灌胃强饲的方法使受孕雌鼠暴露于TCDD中并产下子鼠，再采用自体移植法建立子鼠EMs模型，成功构建了二恶英暴露的EMs小鼠模型；Bruner-Tran等[35]采用了宫内+哺乳期暴露模式直接暴露雌鼠胎儿及其生殖细胞，成功培育出毒物暴露小鼠并进一步研究了暴露毒素在EMs中的潜在机制。越来越多的研究表明，EMs的多基因遗传易感性与环境因子有关[36]，毒物暴露小鼠模型的建立及应用可以更好地研究环境、内分泌因素与遗传因素在EMs病因学中的相互密切关系，为探索EMs的机制与治疗提供了新的思路。

6 总结与展望

EMs作为一种复杂的妇科疾病一直以来都是研究的焦点，虽然随着动物模型的不断发展与完善，为EMs发病机制，治疗等方面的认识提供了很大帮助，但由于该病很多方面的研究依然不甚完善，故而在未来的研究中，动物模型的创新与选择仍是实验的重要且首要部分。小鼠构建的模型因小鼠的各种优点而具有较其他动物的优越性，操作方便，成功率高，已然成为了众多实验的首选。尽管如此，现阶段各种小鼠模型中仍旧存在着不可避免的不足之处，限制了EMs的研究进展，故各研究者应该根据其研究目的，综合衡量考虑，充分发挥各种模型的最优点，选择最合适的模型，以便更好的研究中医药治疗EMs的作用机理，为中医药治疗EMs提供客观依据。