P2Y12敲除在LPS诱导的急性肺炎肺损伤中的保护作用

张 鹏，潘改燕，孙巨军

(1.西安市工会医院a.检验科；b.肿瘤科，西安 710100；2.西电集团医院检验科，西安 710077)

肺炎是由细菌、病毒、真菌等致病微生物引起的发生在终末气道、肺泡和肺间质的炎症[1]。然而随着肺炎临床治疗过程中耐药菌的出现[2-3]，寻找新的抗肺炎药物成为临床药物研究新的挑战。嘌呤P2受体家族是比较复杂的受体家族之一，可分为门控离子通道P2X受体和G蛋白偶联P2Y受体，目前已发现7种P2X受体和8种P2Y受体。其中P2Y受体在体内分布广泛，功能复杂，迄今为止已发现的P2Y受体有P2Y1、2、4、6、11、12、13、14[4]。现在的研究发现，P2Y12受体基因与肺部炎症和哮喘的发病密切相关[5]。

脂多糖(LPS)是内毒素的主要成分，存在于革兰阴性菌细胞壁的外膜，是现在常用的动物肺炎诱导试剂[6]。本研究通过检测小鼠肺支气管灌洗液(BALF)中中性粒细胞比例和蛋白质含量，并通过HE染色观察肺组织肺损伤情况以及ELISA法检测肺组织中炎症因子水平，用于评价P2Y12敲除对LPS诱导的急性肺炎小鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

LPS购自美国Sigma公司；HE染色试剂盒购自西安百萤生物科技有限公司；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)ELISA试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.2 实验动物

8周左右C57BL/6J背景P2Y12 KO小鼠(P2Y12 KO组)以及WT小鼠(WT组)购买自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。小鼠均饲养在SPF级动物房内，室温(23±1)℃，昼夜循环12 h。将WT组和P2Y12 KO组小鼠随机分为磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理组(对照组)和LPS处理组(LPS组)2个亚组，每个亚组小鼠40只。LPS组小鼠给予单次腹腔注射LPS(5 mg·kg-1)，建立小鼠急性肺炎模型；对照组小鼠注射等体积PBS。将各亚组小鼠分成2部分，一部分用于生存分析，每组20只，每天观察并统计小鼠死亡只数，共观察7 d；另一部分用于生化检测，每组20只，观察PBS处理及LPS处理6、12、48 h生化指标变化情况，每次处理小鼠样本数为4只。所有动物实验都遵从动物福利3R原则，本实验通过本院伦理委员会审查。

1.2 实验方法

1.2.1 BALF收集与检测

小鼠过量乙醚麻醉处死，小鼠四肢固定后打开胸腔暴露肺组织，以静脉滞留针插入气管，以无菌PBS缓慢冲洗肺组织并回收灌注液。取1 mL BALF在多功能生化分析仪上检测中性粒细胞比例；并用RIPA裂解液萃取BALF中总蛋白，并采用BCA试剂盒检测BALF中总蛋白含量。

1.2.2 组织学分析

小鼠过量乙醚麻醉后快速打开胸腔，取出肺组织。肺组织分成2部分，一部分冻存在-80 ℃；另一部分快速固定于4%福尔马林缓冲液中，24 h后进行石蜡包埋处理。石蜡包埋的肺组织，用石蜡切片机切为5 μm厚度的肺组织切片，肺组织切片脱蜡复水后，用HE常规染色后观察其形态学变化，并使用Image Pro Plus软件进行分析。

1.2.3 ELISA分析

取冻存的肺组织，经匀浆后，用RIPA裂解组织，并收集上清液。根据ELISA试剂盒说明书步骤，每个反应孔中加100 μL缓冲液稀释过的抗体，4 ℃包埋孵育过夜，第2天洗板3次。将样品加入上述已包被的反应孔中，37 ℃孵育1 h。洗板后加入酶标抗体，37 ℃孵育1 h。加入TMB底物溶液37 ℃反应30 min，最后加入硫酸终止反应。酶标仪中450 nm检测OD值，根据标准曲线计算出样品中各物质浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准误(Mean±SEM)表示，组与组数据之间的多重比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P2Y12敲除对LPS诱导的急性肺炎小鼠生存率的影响

生存分析结果显示，与WT组比较，P2Y12 KO组小鼠LPS诱导处理后24～168 h生存率明显增加(图1)，表明P2Y12敲除可显著增加急性肺炎小鼠生存率。

2.2 P2Y12敲除对LPS诱导的急性肺炎小鼠BALF中性粒细胞及总蛋白含量的影响

WT组、P2Y12 KO组小鼠LPS处理后各时点BALF中性粒细胞数量及总蛋白含量均较PBS处理显著升高(P<0.05或P<0.01)，而LPS处理后各时点P2Y12 KO组BALF中性粒细胞数量及总蛋白含量均显著低于WT组(P<0.05或P<0.01)，见图2。表明P2Y12敲除可显著降低小鼠LPS后肺损伤程度。

2.3 P2Y12敲除对LPS诱导的急性肺炎小鼠肺组织中性粒细胞募集和肺水肿的影响

HE染色结果显示，WT组小鼠LPS处理24 h后肺组织聚合纤维蛋白染色较PBS处理明显变深，而P2Y12 KO组小鼠LPS处理24 h后肺组织聚合纤维蛋白染色较WT组小鼠LPS处理24 h后明显变浅(图3A)。与WT组比较，P2Y12 KO组小鼠LPS处理24 h后肺组织中性粒细胞募集、肺水肿水平均显著减少(图3B、3C，P<0.01)。表明P2Y12敲除可显著抑制LPS诱导小鼠肺部炎症反应和肺损伤。

2.4 P2Y12敲除对LPS诱导的急性肺炎小鼠肺组织中炎症因子表达的影响

WT组、P2Y12 KO组小鼠LPS处理24 h后TNF-α、IL-6、IL-10和MIP1b表达水平均较PBS处理显著升高(P<0.001)，而LPS处理24 h后P2Y12 KO组TNF-α、IL-6、IL-10和MIP1b表达水平均显著低于WT组(P<0.01或P<0.001)，见图4。表明P2Y12敲除可显著降低LPS诱导的小鼠肺部炎症反应。

3 讨论

肺炎在全球范围内具有较高的发病率，由于抗生素的大规模使用，肺炎的病死率已经得以控制，然而抗生素耐药性问题逐渐成为全球肺炎治疗共同面对的挑战之一[2-3]。非抗生素类药物在肺炎治疗中越来越受到关注，例如针对细菌毒素的中和抗体，针对重症肺炎病理生理变化的抗凝药物、免疫调节剂、生长因子、间充质干细胞等都显示出一定的治疗效果[7]。

P2Y12受体主要和ADP结合，是噻氯吡啶、氯吡格雷和AR-C复合物等作用的靶点[8]。ADP与P2Y12受体结合后与Gi蛋白耦连，抑制腺苷酸环化酶活化，诱发血小板的聚集，从而引起血栓[9]。有研究[10]报道LPS诱导大鼠炎症后氯吡格雷(P2Y12拮抗剂)治疗可降低细胞因子(IL-6和TNF-α)，并减少肺损伤和肝损害。这些结果提示了P2Y12抑制可能在肺炎的发生中起到保护作用。

本实验通过LPS注射建立了小鼠肺炎模型，首先研究了WT和P2Y12 KO小鼠BALF中性粒细胞的变化。中性粒细胞数量是临床肺炎诊断的参考之一，肺炎发生后中性粒细胞数量会显著增加[11]。本实验结果显示，P2Y12 KO小鼠BALF中性粒细胞数量显著低于WT小鼠。随后通过HE染色进一步验证了此结果，P2Y12 KO小鼠肺组织中显示出更少的中性粒细胞募集，并且HE染色结果还显示P2Y12 KO小鼠肺部聚合纤维蛋白染色较浅，肺水肿程度相比于WT小鼠也明显减少。

为进一步验证P2Y12 KO对小鼠在LPS肺炎模型中对肺损伤的保护作用，本研究检测了BALF总蛋白含量。急性肺损伤发生时，细胞释放出大量抗体等蛋白，总蛋白含量将会升高[12]。本实验发现P2Y12 KO在LPS注射后，BALF总蛋白含量明显低于WT组，并且在LPS注射后0～7 d显示出较高的存活率。

有研究[13]发现，LPS在动物体内可引起多种免疫细胞高表达趋化因子和炎症因子，在肺组织中引起中性粒细胞聚集，并增加细胞因子IL-1β和TNF-α的表达。本实验通过ELISA检测小鼠肺组织中炎症因子的表达情况，结果显示，P2Y12 KO小鼠肺组织中TNF-α、IL-6和MIP1b含量明显下降。

综上所述，本研究结果表明P2Y12敲除可显著降低小鼠LPS后肺部炎症反应并减少肺损伤，为肺炎的非抗生素类药物研发提供了新的靶点。