磷脂酶CB1对胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响

赵鹏 孙树凯 翟玉娥 田清武 周廷廷 李靖

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003； 1 检验科； 2 肾内科)

神经胶质瘤(GBM)是人类最常见的原发性恶性脑组织肿瘤，有增殖快、侵袭能力强的特点[1-3]。目前对于GBM的标准治疗方法是手术切除，并通过放疗和化疗辅助治疗，此种方法治疗的GBM患者预后非常差，平均生存率仅为13～15个月[4]。因此，探索GBM的发生机制、寻找靶向生物标志物是目前该肿瘤研究的热点。磷脂酶CB1(PLCB1)基因位于人类染色体20p12，作为最初G蛋白耦联受体与PLCL3异构体耦联，进而催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)转化成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)与二酰甘油(DAG)[5]。PLCB1在细胞内转导中起着至关重要的作用，其激活后会引起细胞内钙的增加，细胞增殖异常，最终导致肿瘤发生[6]。有研究表明，PLCB1的过表达会导致肝肿瘤细胞增殖，并与肝癌的不良预后密切相关[7]。另有研究表明，PLCB1的异常表达与结肠癌密切相关[8]。但目前，PLCB1在GBM中的表达情况鲜见报道，本文的研究旨在探讨PLCB1表达对GBM U87细胞增殖和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取2015年2月—2018年9月于我院经手术切除的50例新鲜GBM组织(GBM组)及其癌旁非肿瘤组织(癌旁组)，每例样本分为2份，另一份用于免疫组化分析，一份用于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测。50例患者术前均未行化疗或放疗等抗肿瘤治疗。所有样本均经病理科检查确诊。患者年龄10～87岁，平均年龄44.9岁；根据GBM分级Ⅰ级3例，Ⅱ级18例，Ⅲ～Ⅳ级29例。GBM U87细胞为本实验室保存。一抗兔抗人PLCB1多克隆抗体购自美国Abcam公司，PrimeScript RT-PCR试剂盒(No. RRO47A)购自日本Takara公司，生物素Biotin购自北京中杉金桥生物技术有限公司，胎牛血清及MEM培养基购自澳大利亚Gibco公司，Con siRNA以及PLCB1 siRNA均购自锐博公司，PLCB1抗体购自美国Abcam公司，ERK1/2抗体、p-ERK1/2抗体以及GAPDH单克隆抗体购自美国Cell signaling公司，HRP标记二抗购自碧云天生物技术研究所，Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化SP法检测GBM组和癌旁组中PLCB1蛋白表达量 根据标准步骤行样本固定、石蜡化、脱蜡、脱水、封闭、冲洗，以一抗兔抗人PLCB1多克隆抗体(1∶200稀释)4 ℃孵育10 h，1×PBS充分冲洗3次，生物素Biotin室温孵育2 h，DAB显色(B液∶C液=1∶50)，1×PBS充分冲洗3次，苏木素复染，烘干封片，于显微镜下进行观察。

1.2.2RT-qPCR检测GBM组、癌旁组、PLCB1 siRNA组和Con siRNA组中PLCB1 mRNA的表达量 Trizol法提取GBM组、癌旁组、PLCB1 siRNA组和Con siRNA组中总RNA，用Trizol对以上各组组织、细胞分别进行消化裂解获取总RNA。RNA反转录合成cDNA，然后进行RT-qPCR。根据试剂盒使用说明配制反应体系，分别比较GBM组和癌旁组、PLCB1 siRNA组和Con siRNA组中PLCB1 mRNA的表达量。每个样品设3个复孔，实验重复3次，取其均值。引物如下：PLCB1基因正向引物：5′-GATGAGCCCAGATGGCCG-3′, 反向引物：5′-AGTTGAGTCATCATCCCACTTGA-3′；β-actin基因正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′[7]。

1.2.3细胞培养 U87细胞系接种于含体积分数0.10胎牛血清的MEM培养基中，于37 ℃、含体积分数0.05的CO2的恒温培养箱中培养至汇合度为80%时，用于后续实验。

1.2.4细胞转染 将GBMU87细胞接种于6孔板内(每孔约5×105个细胞)，用含体积分数0.10胎牛血清的MEM培养基培养，24 h后细胞达到85%融合时，将含体积分数0.10胎牛血清的MEM培养液更换为无血清培养液，再分别加入Con siRNA以及PLCB1 siRNA(Con siRNA组和PLCB1 siRNA组)，并轻摇混匀。培养6 h后，再更换为含体积分数0.1胎牛血清的MEM培养基继续培养48 h，以备用于后续实验。

1.2.5CCK-8法测定GBM U87细胞的增殖情况以胰酶消化Con siRNA组和PLCB1 siRNA组贴壁U87细胞，将U87细胞密度调整为5×108个/L，接种于96孔板中，每组设5个复孔；分别在6、12、24 和48 h时向6孔板中加入CCK-8试剂，室温作用1 h后，采用酶标仪测定波长450 nm处细胞的吸光度，实验重复3次，取均值。

1.2.6Western-blot实验检测GBM组、癌旁组、PLCB1 siRNA组和Con siRNA组中PLCB1蛋白的表达情况 于GBM组、癌旁组、PLCB1 siRNA组和Con siRNA组中加入RIPA细胞裂解液冰上裂解20 min后，13 000 r/min离心15 min取上清液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量测定，并调整蛋白的浓度。加上样缓冲液混匀后煮沸使蛋白变性，后进行SDS-PAGE电泳，电泳至分离胶底部后，电转至PVDF膜上，以体积分数0.05脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，以TBST洗涤3次，每次10 min；将PVDF膜置于PLCB1抗体(1∶1 000稀释)、ERK1/2抗体(1∶1 000稀释)、p-ERK1/2抗体(1∶1 000稀释)以及GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)中，4 ℃过夜，PVDF膜以TBST洗涤3次后加入HRP标记的二抗(1∶10 000稀释)，室温下作者2 h，TBST洗涤3次，Vilber Lourmat凝胶成像系统显色。以Quality One软件分析计算目的蛋白与内参GAPDH蛋白灰度比，以此表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.2.7Transwell实验检测PLCB1蛋白对GBM U87细胞侵袭能力的影响 将Transwell小室放入24孔板中,Transwell小室内为上室,24孔板内为下室。将Matrigel基质胶放置于上室底部膜上，置于37 ℃培养箱中30 min使其凝固。取100 μL无血清培养基的PLCB1 siRNA组和Con siRNA组细胞悬液(细胞密度5×108/L)滴入上室，下室中加入600 μL含血清培养基。培养细胞24 h以后，取出Transwell小室，弃去孔中培养液。将Transwell小室用PBS洗3次后，甲醇固定30 min并风干，再将含体积分数0.1的结晶紫染色20 min，棉签除上层未迁移细胞，最后用PBS洗3次。显微镜下随机观察5个视野细胞并计数，取平均值。

1.2.8划痕实验检测PLCB1蛋白对GBM U87细胞迁移能力的影响 向6孔板当中分别加入约5×105个PLCB1 siRNA组和Con siRNA组GBM U87细胞，于37 ℃培养箱中培养过夜，次日用微移液管的尖端在每个孔中垂直画线，PBS洗3次，加无血清培养基，于37 ℃培养箱中培养24 h，显微镜拍照，观察划痕愈合的情况。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 PLCB1在GBM组织中的表达

RT-qPCR检测结果显示，GBM组以及瘤旁组PLCB1 mRNA表达量分别为58.33±3.03、11.67±2.08，两组比较差异具有显著意义(t=131.29,P<0.01)。免疫组化结果显示，GBM组和癌旁组PLCB1蛋白表达量分别为68.13±2.13、18.04±3.24,两组比较差异具有显著性(t=100.53,P<0.01)。Western-blot实验检测显示，GBM组以及瘤旁组中PLCB1的表达量分别为0.88±0.14、0.24±0.08，两组比较差异有显著性(t=50.25,P<0.01)。

2.2 PLCB1对GBM U87细胞增殖的影响

CCK-8分析检测结果显示，时间、组别以及时间与组别交互作用均对GBM U87细胞的增殖能力具有极显著的影响(F时间=78.48，F组别=50.29，F时间*组别=31.49，P<0.01)。单独效应结果显示，与6 h相比，PLCB1 siRNA组以及Con siRNA组12～48 hGBM U87细胞增殖水平均明显提高(F=53.27～74.23，P<0.01)。与Con siRNA组相比较，PLCB1 siRNA组细胞在48 h时增殖率明显降低(F=61.16，P<0.05)。见表1。

表1 两组U87细胞各时间点增殖情况比较

2.3 PLCB1对GBM U87细胞侵袭能力的影响

Transwell法检测的结果显示，Con siRNA组以及PLCB1 siRNA组U87细胞的侵袭率分别为16.44±1.16、4.44±0.64，两组比较差异具有显著性(F=29.96，P<0.05)。

2.4 PLCB1对GBM U87细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，Con siRNA组和PLCB1 siRNA组细胞侵袭率分别为81.44±4.49、26.34±3.60)，两组比较差异具有显著意义(F=55.71，P<0.05)。见图1。

A:未处理的GBM U87细胞，B:Con siRNA组，C:PLCB1 siRNA组

2.5 Western-blot实验检测PLCB1、ERK1/2以及p-ERK1/2蛋白表达

Western-blot检测结果显示，PLCB1 siRNA组和Con siRNA组中PLCB1蛋白的相对表达量分别为1.27±0.20、0.23±0.09，与Con siRNA组相比较，PLCB1 siRNA组PLCB1蛋白的表达量明显下降(F=26.42，P<0.01)；两组p-ERK的表达量分别为1.62±0.17、1.11±0.24，与Con siRNA组相比较，PLCB1 siRNA组p-ERK蛋白的表达量明显下降(F=17.98，P<0.01)。GBM组和瘤旁组PLCB1蛋白的相对表达量分别为1.60±0.19、0.43±0.09，GBM组中PLCB1蛋白表达量明显高于瘤旁组(F=24.67，P<0.01)，p-ERK1/2蛋白的相对表达量分别为1.91±0.21、1.32±0.31，GBM组中p-ERK1/2蛋白的表达量明显高于瘤旁组(F=18.65，P<0.01)。见图2。

A:Con siRNA组，B:PLCB1 siRNA组，C:GBM组，D:瘤旁组

3 讨 论

基因的异常表达可能会导致肿瘤细胞信号通路被异常激活，继而影响细胞生物学功能[9-10]。在一些疾病中均发现PLCB1存在异常表达，并参与这些疾病的发生发展[11-14]，如在乳腺癌组织样本中发现PLCB1基因表达异常，其过表达与肿瘤分级和细胞增殖有关[15]。在结肠癌中PLCB1过表达可诱导肿瘤的发生，增强肿瘤侵袭能力[16]。PLCB1能编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，在癌细胞中可激活、催化G蛋白使其产生第2信使，并可激活细胞内转导信号，最终导致细胞异常增殖[5]。然而，PLCB1在GBM中的表达及作用机制尚不清楚。

GBM是一种最为常见的中枢神经系统肿瘤，病程进展较为迅速，其较强的侵袭性导致术后复发率极高，目前治疗方法比较局限，生存率极低，严重威胁着人类的生命健康[17-21]。因此，寻找GBM新的治疗策略、确定更多的治疗靶点尤为重要。本研究本通过对50例临床标本的检测分析，结果表明与癌旁组相比，GBM组中PLCB1 mRNA和蛋白表达水平均明显增高，即PLCB1高表达于GBM中。为进一步探讨PLCB1对GBM U87细胞的影响，本研究又将PLCB1 siRNA以及Con siRN分别转染至U87细胞后，采用CCK-8法分析检测PLCB1对两组细胞增殖情况的影响，结果表明PLCB1 siRNA可以明显抑制GBM U87细胞的增殖；Transwell实验和划痕实验检测PLCB1对两组细胞侵袭和迁移情况的影响，结果表明，与Con siRNA组相比，PLCB1 siRNA组细胞侵袭和迁移能力明显受到抑制。即在GBM细胞中，PLCB1会导致细胞的增殖、侵袭及迁移，提示PLCB1可能对肿瘤的侵袭和转移起到重要作用。但目前对其导致GBM发生发展的具体通路机制还不明确，有研究表明PLCB1可正向调节ERK[7]，而EKR广泛参与许多恶性肿瘤的发生发展[22]。在90%GBM中p-ERK表达量会明显升高，从而调节细胞的增殖、分化[23-24]。本研究通过对GBM组织以及细胞中ERK信号通路相关蛋白ERK1/2和p-ERK1/2的检测发现，PLCB1可以激活影响细胞生长和凋亡的ERK信号转导通路。

综上所述，本研究首次在GBM患者临床标本及细胞中发现PLCB1存在特异性上调，其过表达在GBM的发生发展过程中起到重要作用。此外，在GBM组织中，由于PLCB1与细胞侵袭性密切相关，其可能成为预测GBM的潜在标志物，为今后GBM的治疗提供新思路和策略。