缬沙坦对主动脉球囊损伤大鼠主动脉内膜SRSF1表达的影响

彭亮 段硕 李永红 徐辉 杨茜 唐锡龙

(1 青岛大学医学院附属医院心内科，山东 青岛 266003； 2 平邑县人民医院急诊科； 3 武汉亚洲心脏病医院心内科)

血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖是血管内膜增生的关键，内膜增生是一种普遍而严重的病理过程，可导致动脉硬化、血管成形术后再狭窄等[1]。当血管发生损伤时，VSMCs迁移到内膜，开始增殖并分泌细胞外基质，导致动脉内膜扩张，即新生内膜形成，从而进一步导致严重的心血管疾病，如高血压、缺血性疾病等[2]。研究发现缬沙坦在降低血压的同时，还能抑制血管平滑肌细胞的迁移与增殖，减轻血管内皮损伤后内膜的增生，降低术后血管再狭窄的发生[3-5]。丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(SRSF1)是选择性剪接因子家族的典型成员之一,其在调控mRNA代谢、维持基因组稳定性、调控细胞活力以及调节细胞周期进展方面发挥着关键的作用[6-9]。但SRSF1在血管系统中具体的作用机制尚不清楚。最近有研究发现SRSF1在调节内皮细胞衰老及促进血管平滑肌细胞增殖方面发挥重要作用[9-11]。本研究通过观察缬沙坦治疗前后球囊损伤模型中大鼠主动脉血管内膜SRSF1的表达情况，探讨缬沙坦对血管内皮损伤后再狭窄的作用及其机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组与处理

取健康雄性Wistar大鼠48只，体质量为250～300 g，购买于青岛大学医学部实验动物中心。随机分为对照组、手术组和缬沙坦组，每组各16只大鼠。适应性饲养2周后，从术前1 d至术后14 d(或28 d)，手术组和对照组大鼠每天分别给予5 mL蒸馏水灌胃，缬沙坦组大鼠每天将20 mg/kg缬沙坦溶于5 mL蒸馏水中进行灌胃。大鼠称体质量后以3 g/L的戊巴比妥钠(20 mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，取颈部正中切口切开皮肤，仔细分离血管后，使用注射器经颈总静脉给予100 U/kg低分子肝素钠抗凝。手术组和缬沙坦组大鼠均行主动脉球囊损伤术，操作方法如下：将自制的2F球囊导管自大鼠的左颈总动脉缓慢插入至腹主动脉下端，以0.08～0.10 mL无菌氯化钠盐水充盈球囊，将导管向不同方向抽拉3次，使主动脉内膜充分剥脱；对照组大鼠操作与手术组相同，但未注水充盈扩张球囊。所有大鼠手术完成后，缝合并且消毒切口，然后肌注200 000 U青霉素预防感染。各组分别于术后第14天和第28天处死各8只大鼠，收集近主动脉弓血管5 mm，以40 g/L多聚甲醛溶液固定后备用。

1.2 大鼠主动脉血管内膜增生的检测

将固定好的血管以石蜡包埋并5 μm厚切片，经苏木精-伊红(HE)染色后，普通光学显微镜下观察血管内膜增生情况，使用Simple PCI图像分析系统检测内膜厚度。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血管组织中SRSF1 mRNA表达情况

使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司，美国)从血管组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，SRSF1上游引物序列：5′-CACTGGTGTCGTGGAGTTTGTACGG-3′，下游引物序列：5′-GGGCAGGAATC-CACTCCTATG-3′，扩增片段长为126 bp。内参β-actin上游引物序列：5′-CCTAGACGTCGATCAA-GAGA-3′，下游引物序列：5′-GGAACGAAGGCT-CGAAGA-3′，扩增片段长为126 bp。使用PCR仪进行扩增，以2-△△CT方法比较样本基因表达差异。

1.4 免疫荧光法检测血管组织中SRSF1蛋白表达

将血管标本石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇水化、脱蜡后，在乙二胺四乙酸溶液中煮沸进行抗原修复。滴加兔抗SRSF1(1∶80)一抗(Thermo Fisher公司，美国)，将载玻片放入湿盒内4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤3次，每次5 min。滴加二抗，室温下避光孵育50 min。PBS洗涤后，用DAPI溶液对细胞核染色5 min，PBS洗涤3次后，滴加防萃灭剂，封片。将切片置于徕卡倒置荧光显微镜下进行观察并采集图像。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠血管组织的形态学比较

对照组大鼠主动脉球囊损伤术后第14天和第28天时主动脉内膜光滑，均无明显损伤及斑块形成，而手术组和缬沙坦组血管内均可见新生内膜增生，创面均有不同程度的内皮细胞覆盖，内弹力膜部分断裂(图1A～F)。手术后第14天，对照组、手术组以及缬沙坦组血管内膜的厚度分别为(23.70±8.64)、(88.31±8.07)、(74.59±8.12)μm。术后第28天的内膜厚度分别为(25.47±8.34)、(117.04±8.23)、(80.65±8.14)μm。重复测量设计的方差分析结果显示，组别、时间、时间与组别(交互作用)对大鼠主动脉血管内膜的厚度均有显著影响(F组别=372.90，F时间=26.13，F交互=12.31，P<0.05)；与对照组相比，术后第14、28天手术组与缬沙坦组内膜厚度均明显增加，缬沙坦组内膜厚度较手术组明显降低(F=176.43、241.08，P<0.05)。

2.2 各组血管组织中SRSF1 mRNA表达情况

RT-qPCR检测结果显示，术后第14天，对照组、手术组、缬沙坦组血管内膜SRSF1 mRNA相对表达量分别为(0.24±0.17)、(1.17±0.15)、(0.72±0.13)。术后第28天SRSF1 mRNA的相对表达量分别为0.27±0.12、1.52±0.19、0.98±0.19。重复测量设计的方差分析结果显示，组别、时间以及时间与组别(交互作用)对大鼠主动脉血管内膜SRSF1 mRNA相对表达量具有显著影响(F组别=184.60，F时间=21.15，F交互=4.22，P<0.05)。单独效应结果显示，术后第14、28天，手术组、缬沙坦组血管内膜SRSF1 mRNA的相对表达量较对照组明显升高，缬沙坦组SRSF1 mRNA的相对表达量较手术组明显降低，差异有统计学意义(F=23.18、32.71，P<0.05)。

2.3 各组血管组织中SRSF1蛋白的表达情况

免疫荧光检测结果显示，术后第14、28天对照组大鼠血管组织中SRSF1蛋白荧光强度极低，手术组和缬沙坦组荧光强度显著高于对照组，缬沙坦组荧光强度明显低于手术组。与术后第14天相比，术后第28天手术组、缬沙坦组血管组织中SRSF1蛋白荧光强度均明显增加，见图2A～2F。

A～C分别为对照组、手术组、缬沙坦组术后第14天内膜增生情况；D～F分别为对照组、手术组、缬沙坦组术后第28天内膜增生情况，HE染色，200倍

A～C分别为对照组、手术组、缬沙坦组术后第14天血管组织中SRSF1蛋白的表达情况；D～F分别为对照组、手术组、缬沙坦组术后第28天血管组织中SRSF1蛋白的表达情况，免疫荧光染色，200倍

3 讨 论

在经皮冠状动脉介入治疗(PCI)过程中，球囊扩张与支架展开时对血管壁造成的机械性损伤，一直是引起术后血管再狭窄的重要因素，严重影响患者预后[12]。因此，有效地预防血管再狭窄的发生，可进一步提高PCI的治疗效果。研究表明，PCI术后再狭窄的发生可能与血管弹性回缩、炎症反应及VSMCs过度增殖等有关[13]。

在正常情况下，VSMCs在动脉血管中膜中是维持非增殖状态的[14]。当受到损伤或其他刺激时，VSMCs迁移到内膜，开始增殖并分泌细胞外基质，促进新内膜的形成，可能是导致PCI术后严重心血管系统并发症，如高血压、缺血性疾病以及后续的心肌梗死、中风和充血性心力衰竭等的主要原因[15]。VSMCs异常增殖与动脉粥样硬化和损伤后新内膜形成导致的再狭窄密切相关[16-17]。本研究中，球囊损伤主动脉内皮后手术组及缬沙坦组以术后第14、28天血管内均可见新生内膜增生，创面均有不同程度的内皮细胞覆盖，内弹力膜部分断裂，血管内膜较对照组明显增厚，说明血管损伤后由于血管内膜增生形成了血管再狭窄。与术后第14天相比，手术组术后第28天血管内膜的增生程度进一步加重，提示血管损伤后再狭窄的程度会随着时间的推移进一步加重。而使用缬沙坦药物干预后，术后第14、28天的血管内膜增生程度均明显小于未使用药物干预的手术组，血管内皮的增生程度变轻。提示缬沙坦可有效减轻血管内膜损伤后内膜的增生情况。

SRSF1参与多种病理过程，包括病毒感染和肿瘤的发生、发展等过程[18-20]。有研究表明，SRSF1的上调可促进动脉损伤时VSMCs的增殖响应或促进有丝分裂刺激新内膜形成，而SRSF1的缺失则减弱了血管损伤或者有丝分裂刺激的反应[20-24]。XIE等[11]研究显示，SRSF1通过Δ133p53/EGR1/KLF5路径促进VSMCs的增殖。由于增强的VSMCs增殖与许多血管增生性疾病的发病有关，因此应该对包括动脉粥样硬化、支架内冠状动脉再狭窄等疾病采取抗增殖治疗[25-26]。本研究中，手术组及缬沙坦组血管组织中SRSF1 mRNA相对表达量较对照组均明显升高，但缬沙坦组SRSF1 mRNA表达量较手术组降低，本研究结果也验证了上述观点。

缬沙坦作为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)的代表药物，除了具有降压作用外，还可以通过抑制VSMCs的迁移及增殖，减轻血管内膜损伤后内膜的增生，降低术后再狭窄的发生[27-30]。本研究中，手术组血管内膜厚度明显高于缬沙坦组，说明血管内膜损伤后SRSF1的mRNA及蛋白均是高表达，经缬沙坦治疗后，损伤的血管组织中SRSF1 mRNA以及蛋白表达水平较治疗前均明显降低，内膜增厚程度明显受限，说明SRSF1 mRNA以及蛋白在调节VSMCs增殖及其在新内膜增生的发病机制中发挥重要作用。

由此可以推断SRSF1可能通过促进VSMCs的迁移和增殖，进一步促进血管损伤后内膜增厚。SRSF1在增生的血管内皮及平滑肌细胞中表达增加，可能与其促进平滑肌细胞增殖和新生内膜增厚有关。SRSF1表达的变化是否与缬沙坦的作用直接相关，目前仍未知。总之，缬沙坦可有效减轻内膜损伤血管的内膜增生程度，其作用机制可能与其下调血管组织中SRSF1 mRNA及蛋白的表达有关。