拉曼光谱技术与神经退行性疾病研究进展

周珂轩 梁昊岳 孔晓冬

1天津医科大学总医院保健医疗部（老年医学科），天津市老年病学研究所（天津 300052）；2中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所），实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心（天津 300020）

神经退行性疾病是老年人认知功能障碍的常见病因，最常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）、帕金森病（Parkinson′s disease，PD）、多系统硬化（multiple Sclerosis，MS）、亨廷顿舞蹈病（Huntington′s disease，HD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等。上述疾病都有不同的流行病学、临床症状、实验室和神经影像特征、神经病理学和治疗方法，其临床表现多种多样，主要表现为进行性认知功能障碍［1-2］。近年来，尽管神经退行性疾病的诊断方式日益增多，但随着拉曼光谱技术的发展及其在多个领域中的广泛应用，其在神经医学诊断中的价值也日益提高［3］。

1 神经退行性疾病诊断现状

神经退行性疾病发病的分子机制还未完全明了，是导致老年人群疾病和残疾的主要原因，造成重大的社会经济负担［4］。神经退行性疾病的特征是与疾病相关的靶神经元的物理衰退，并最终失去周围的非特异性神经细胞支持［5］。目前临床诊断方式多样，常用的手段如颅脑MRI、CT、PETCT、病理诊断、脑脊液生物标记物技术等，以上检查手段或操作复杂，或费用昂贵，对神经退行性疾病诊断敏感度和特异度不高，诊断效果并不理想，亟待发现一种简便快捷的诊疗手段［6］。

2 拉曼光谱技术

拉曼光谱技术（Raman spectroscopy，RS）即拉曼散射产生的光谱，是1928 年由印度物理学家拉曼发现的［7］。即一定频率的光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射，弹性散射的散射光是与激发光波长相同的成分，非弹性散射的散射光有比激发光波长长的和短的成分，统称为拉曼效应。由于拉曼谱线的数目、位移的大小、谱线的长度直接与试样分子振动或转动能级有关，因此，这项技术可探测与样品中化学键相关的分子振动或旋转，以获得关于分子结构、组成和分子间相互作用的信息［8］。作为一种研究分析结构的工具，拉曼光谱从物质分子非弹性散射产生的分子振动光谱识别和区分不同的化学结构及官能团，具有快速、非破坏性及微量精细分辨能力、标本无需处理、不用试剂和高度自动化、相对低的成本提供实时分子信息和高分辨率成像等优点，在医学领域发展迅速，如癌症的早期诊断及结石病、白内障、动脉硬化等疾病的诊断研究，已获得很多突破性进展［9-10］。拉曼光谱技术只需简单的试样准备，可在近乎生理条件下保留医学试样，并可用于活体试样，能为医疗过程中实时诊断提供可能性，这是其他技术所不具备的。现已发展表面增强拉曼光谱技术（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）、尖端增强拉曼光谱技术（tip enhanced Raman spectroscopy，TERS）、傅里叶变换拉曼光谱技术（fourier transform Raman spectroscopy，FT-Raman）、共振拉曼散射（resonance Raman scattering，RRS）、相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-stokes Raman scattering，CARS）等，广泛用于生命科学研究［11-12］。

3 拉曼光谱技术在神经退行性疾病中的作用

拉曼光谱技术可以提供快速、无标记、实时的信息，这对于研究神经环境是至关重要的［10］。研究表明，傅里叶变换红外光谱可对各种样品类型进行极快速、高通量和非破坏性的分析，它能够以最少的样品制备同时分析碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、脂质、蛋白质、核酸和多糖，因此被认为是一种有价值的代谢指纹分析工具，目前是诊断痴呆的一种有用且准确的方法［13］。研究发现，利用尖端增强拉曼光谱技术作为纳米尺度上具有空间分辨率的表面敏感工具，可以检测由相同多肽序列和不同毒性水平形成的两个样品中单个蛋白质低聚物的空间结构和表面特征［14］。已有研究表明，淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）与Aβ42或Aβ40 与Aβ42 的比值可能是AD 有研究前景的生物标志物，表面增强拉曼散射技术利用胶体合成银纳米探针，可高灵敏性、选择性和多重检测血液中的Aβ40 和Aβ42，并且不受水分干扰、非光漂白的特点使其成为检测各种神经退行性疾病生物标志物的重要研究工具［15］。

与既往神经退行性疾病诊断方法相比，拉曼光谱技术具有独特的优势。这些优势主要在于拉曼光谱可以提供特定和敏感的生物标志物指纹，无需贵重基材或抗体标记、非侵入性、并且几乎不需要样品制备，有可能在便携式、低成本的平台上进行快速、多路分析。同时，在不损害标本的情况下，可以确定正常和疾病组织的特征，了解神经退行性疾病发生和发展的潜在机制，并进行治疗效果观察。基于这些优势，拉曼光谱与多变量分析等方法相结合，可以很好地进行细胞或分子水平的检测，为低成本快速鉴别神经退行性疾病提供了新的方法和思路。

但是，这项技术同样也存在一些不足，由于拉曼光谱技术目前还在不断完善，其信噪比相对较低、光谱解释复杂、信息化程度不高，缺少大规模实验数据统计分析和信息化程度高、操作方便的软件作为支撑，同时，较长的采集时间以及从患者样本到光谱采集的低效工作流程等，给临床工作带来一定的挑战，使该项技术尚未作为常规临床技术引入［16-17］。

3.1 拉曼光谱技术与ADAD 是一个日益严重的全球健康问题，对个人和社会都有巨大的影响，目前全世界有4 400 万人患有痴呆症。AD 的主要病理特征是淀粉样斑块Aβ 和神经原纤维缠结，并且可有神经元变性，突触和神经元丢失。其最常见的临床表现是潜伏的、进行性的认知功能障碍及近期记忆力丧失。疾病后期，可能会出现行为改变、行动能力受损、幻觉和癫痫［18］。早期识别和诊断AD显得尤为重要。MICHAEL 等［19］利用高光谱拉曼显微镜对4 名捐赠者（包括3 名AD 和1 名健康志愿者）的额叶皮质组织和海马组织切片进行分析。在样本中含有Aβ 斑块的区域发现蛋白质含量、β-折叠含量和自体荧光明显较高，这表明该技术可以用来识别AD 患者脑组织中斑块的位置。PALOMBO 等［20］使用拉曼显微镜对患有AD 的小鼠大脑中含有Aβ 斑块组织的化学图谱进行了绘制，发现这些斑块的核心富含蛋白质，包裹着一层脂质环。脂质环被认为是由这些区域中大量的星形胶质细胞造成的，这可能表明神经炎斑块和慢性神经炎之间的联系。LOPES 等［13］用傅里叶变换红外光谱研究AD 患者单核白细胞的酰胺I 带平均光谱的结果表明，对照组和中度AD患者组在1 640 cm-1～1 625 cm-1范围内存在差异，此区域是检测Aβ 的峰位范围。在此光谱范围内，1 631 cm-1和1 638 cm-1处波峰明显增强，并分别与Aβ 折叠结构和β-折叠蛋白有关。另外，1 683 cm-1处的增强峰也与β-折叠有关，所有这些差异在AD 中都很明显，并与氧化应激相关。另一项研究也提示，富含Aβ40 和Aβ42 的蛋白质或多肽区域导致1 672 cm-1处波峰增强，而1 658 cm-1处波峰减弱被认为与α-螺旋结构有关。

3.2 拉曼光谱技术与帕金森病帕金森病是全世界第二大常见的神经退行性疾病［21］，其主要临床特征为运动症状，如震颤、僵硬、运动迟缓、步态和平衡障碍以及非运动症状，包括认知下降、行为、感觉、睡眠和自主神经问题［22］。帕金森病的病理特征是大脑基底节，特别是黑质的细胞死亡，以及α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-SYN）在许多剩余神经元中的积聚。多巴胺能黑质纹状体神经元与路易小体的变性被认为是帕金森病运动障碍的主要神经病理相关因素［21-23］。错误折叠的α-SYN 堆积成病理性聚集体被认为在帕金森病的发病机制中起着中心作用，可引起细胞毒性，并导致细胞死亡，α-SYN 还促进线粒体功能障碍，干扰内质网和高尔基体功能，扰乱细胞器轴突运输［22］。成像生物标记物正越来越多地应用于帕金森病的诊断，为临床观察提供支持，包括分子成像、经颅超声、磁共振成像和光学相干断层扫描［24］。近年来，细胞外囊泡（extracellular Vesicles，EVS）被认为是α-SYN 在全身转移的载体和关键角色，参与错误折叠的α-SYN 的传播，从而参与疾病的传播。EVS 可能是α-SYN 聚集的加速器，作为多种PD 相关分子的载体，被认为是PD 的新生物标志物，但在临床环境中对其检测和表征存在一定的技术局限性。GUALERZI 等［23］应用拉曼光谱技术用于细胞外囊泡的分析，作为帕金森病的诊断和预测工具。帕金森病患者和健康人的血清中提纯EVS 后，对EVS 进行拉曼光谱分析，证明该方法在区分帕金森病患者和对照组方面具有一定的准确性，还证明了拉曼数据与帕金森病临床评分之间的相关性。循环中EVS 的拉曼光谱可以作为帕金森病患者分层、评估康复和药物治疗效果的可靠、自动化和灵敏的方法。在帕金森病研究领域，拉曼光谱被用于研究单体和聚集的α-SYN 的结构特征和变化。此外，拉曼光谱技术还被用于分析帕金森病患者的血液，检测患者血浆的光谱指纹与健康对照组的不同，还可以提供对样品的整体生化特征的洞察力，在EVS 光谱中可以清楚地检测到与核酸、蛋白质和脂质相关的峰。帕金森患者出现的视觉障碍是其发病的重要原因，研究发现，拉曼光谱可以区分正常和病变视网膜，也可以检测与帕金森病相关的视网膜病变的分子变化，α-SYN 的累积可能导致神经炎症、代谢失调和感光细胞死亡。MAMMADOVA 等［25］证明了使用拉曼光谱来识别表达人A53T 基因α-SYN 突变的转基因小鼠模型TgM83 视网膜组织中疾病特异性分子特征的方法。结果表明，拉曼光谱可能成为有帕金森视网膜病变患者安全、有效的早期诊断途径。

3.3 拉曼光谱技术与脱髓鞘疾病IMITOLA 等［26］描述了一种新的成像策略，将视频率反射和荧光共聚焦成像与相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜相结合，应用于慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎（chronic experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）动物的活体组织，观察到EAE 动物胼胝体和脊髓局部有严重的脂质信号丢失，提示脱髓鞘，轴突反射信号丢失。还观察到出生后第7 天小鼠的小脑皮质下白斑（无髓鞘）和7 周龄小鼠（正常有髓）小脑的拉曼光谱信号，发现在发育的髓鞘形成过程中光谱信号增加。观察结果表明，CARS 和反射成像相结合可以显示正常成人和发育中的中枢神经系统的有髓轴突和无髓轴突。FU 等［27］利用CARS 显微镜和共聚焦拉曼显微光谱相结合的方法记录了不同阶段复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的髓鞘的拉曼光谱，用CARS 成像定位了空白对照组白质中的正常髓鞘、脱髓鞘病变中的髓鞘碎片和缓解期再生的髓鞘。并且发现CARS 图像能够量化不同疾病阶段的髓鞘厚度，并确定髓鞘厚度与轴突直径的比率。CARS 显微镜可以有效地测定脱髓鞘疾病中脱髓鞘和再髓鞘形成的情况及髓鞘修复治疗的结果。

多系统硬化是中枢神经系统的一种慢性炎症性退行性疾病，以脱髓鞘和轴突变性为特征，然其病因尚不清楚，其症状、病程和转归各不相同。多发性硬化症通常影响20～40 岁的患者，是美国和欧洲年轻人残疾的主要原因［28-29］。多发性硬化患者与普通人群相比，其死亡率更高，预期寿命更短，在患有精神疾病、心脑血管疾病、糖尿病或癌症等并存疾病的患者中更为明显。成像技术的进步和诊断标准的不断改进使MS 早期诊断成为可能［30］。BERGHOLT 等［28］开发了一种新的共注册拉曼光谱和解吸电喷雾电离质谱（desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI-MS）结合免疫荧光成像的相关异谱脂质体（heterospectral lipidomic，HSL）方法用于动物模型和多发性硬化症患者尸检脑组织髓鞘的分类和分子表征，并首次用于直接观察新形成的髓鞘与正常髓鞘组织成分的不同。结果表明，拉曼光谱不仅可以区分正常的、脱髓鞘的和有髓鞘的区域，还可以识别对照组织和重新髓鞘组织之间的脂质成分存在差异。在多系统硬化患者中，灰质和视网膜遭受慢性弥漫性炎症过程，损害视网膜神经元。将拉曼光谱应用于多系统硬化损伤的视网膜各层，可以揭示多系统硬化所发生的分子变化，更好地探索多系统硬化的发病机制。MARRO 等［31］利用器官型视网膜培养物的拉曼光谱作为分子成像工具来研究视网膜疾病，监测了视神经炎小鼠整个炎症反应过程中视网膜的生化成分，包括脂氧合酶、iNOS、TNF-α、细胞色素C、苯丙氨酸、NADH/NAD+和磷脂酰胆碱。此外，这些分子的含量反映了与视网膜炎症相关的组织损伤。结果表明，视网膜的拉曼光谱结合偏最小二乘分析和多变量曲线分辨率分析可作为检测、研究和监测视网膜和脑部疾病的一种有用的分子成像技术。

神经系统脱髓鞘疾病分型、分期复杂，起病更为隐匿，多为散发病例，发病率不高，病情进展快，病死率较高，起病方式及临床表现多种多样。疾病早期往往不被患者重视，症状出现前即可有相应的病理生理改变，难以进行早期诊断及鉴别诊断，必要时需取死亡患者脑组织标本进行病理分析确诊，标本获取困难，且不符合人类伦理要求。而动物模型相对容易建立，操作简单、可控性强。综上所述，目前拉曼光谱技术在神经系统脱髓鞘疾病中的研究还处于动物实验阶段，早期发现人类血清或脑脊液中特异性生物标志物对神经系统脱髓鞘疾病显得尤为重要。

3.4 拉曼光谱技术与其他神经退行性疾病亨廷顿病是由亨廷顿蛋白基因（Huntingtin gene，HTT）第一外显子中显性遗传的CAG 重复扩增引起的常染色体显性遗传性神经退行性疾病，以渐进性不自主舞蹈性运动、行为和精神障碍以及痴呆为特征［32］。早期检测和识别HD 发病的生物标志物对疾病的治疗和预后至关重要。HUEFNER 等［33］首次使用SERS 发现在雌性R6/2 小鼠（一种HD 转基因小鼠模型）的皮质匀浆和血清样本中有突变的亨廷顿聚集体累积并具有特定的光谱特征，发现HD小鼠与对照组相比在400 cm-1～1 200 cm-1光谱范围内有明显差异，并且证明在HD 患者中通过SERS 获得其光谱生物标志物的可行性，提出这种方法可能在HD 的早期诊断和治疗中发挥重要作用。

ALS 是一种成人起病的慢性、致命性神经退行性疾病，以大脑和脊髓运动神经元变性为特征，可导致进行性肌肉瘫痪，最终死于呼吸衰竭［34］。ZHANG 等［35］使用SERS 发现ALS 患者和健康对照组血浆样本在722 cm-1和739 cm-1处存在显著光谱学差异，ALS 患者在722 cm-1处腺嘌呤和辅酶A 强度明显高于对照组，在739 cm-1处胸腺嘧啶和尿嘧啶也显示出较高的信号，提示ALS 患者血浆中存在较高水平的DNA 或RNA 碱基。ALS 以胞浆内有毒蛋白聚集为显著特征，氨基酸代谢异常可能与ALS 的发生发展有关。SERS 光谱也可以检测到ALS 患者血浆中的几种特征性氨基酸，包括精氨酸（493 cm-1）、酪氨酸（635 cm-1、1 618 cm-1）、色氨酸（760 cm-1、1 198 cm-1和1 618 cm-1）、L-丝氨酸（808 cm-1）和苯丙氨酸（1 001 cm-1和1 198 cm-1）等。以上研究表明，ALS 患者中葡萄糖、氨基酸及核苷酸等生物分子代谢异常有可能成为其潜在的生物标志物。

4 结论与展望

拉曼光谱技术是疾病诊疗中的一股新生力量，虽存在着一些不足，如光谱数据信号的有效处理、统一金属粒子制备对表面增强拉曼光谱检测的可重复性等。但是它与其他技术整合可能更具有发展潜能，为神经退行性疾病的诊断和治疗开辟了新的领域［36］。在今后的临床工作中可将拉曼光谱技术特定峰位与患者血清学生化指标相结合，例如，血清胆固醇、低密度脂蛋白、尿酸和腺苷脱氨酶等。深入探索拉曼光谱技术在神经退行性疾病研究中的应用，不仅有助于神经系统疾病的诊断，也可为预测疾病的预后提供方法学指导，具有广阔的临床应用前景。