尿ZAG、KIM-1和NGAL联合检测在糖尿病肾病诊断中的价值

储 辉，林 宁，刘艳秋，陆卫平△

1.南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科，江苏淮安 223000；2.江苏省淮安市第一人民医院分院检验科，江苏淮安 223002

随着人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加[1]。临床上糖尿病中最常见，致死率、致残率最高的并发症是糖尿病肾病(DN)。DN是一种微血管并发症，临床主要表现为肾小球硬化、肾小球基底膜增厚、肾间质纤维化、高血压、高蛋白尿及肾小球滤过率降低[2]。目前，临床上主要依据血尿素氮、血清肌酐、估算肾小球滤过率(eGFR)和尿微量清蛋白(mAlb)来诊断DN和判断DN的进展[3]。 然而，这些标志物常在肾损伤早期由于肾脏的代偿作用而受到影响，致使其诊断灵敏度和特异度低，不能及时确诊早期DN。研究表明糖尿病患者肾小管的损伤要早于或伴随肾小球损伤，因此，肾小管损伤相关分子在诊断早期DN中可能更有价值[4]。目前，在DN的早期诊断上还存在众多挑战。有研究认为尿液中肾损伤分子1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和锌-α-2-糖蛋白(ZAG)能反映DN的发生与发展[5-7]。本研究拟通过酶联免疫吸附测定(ELISA)同时检测尿液中ZAG、KIM-1和NGAL的水平，探讨三者联合检测在DN诊断中的价值，为DN诊断寻找临床依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1-12月南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科住院的DN患者77例，其中男40例、女37例，平均年龄(63.1±6.2)岁。选取同期该院体检健康者38例为健康对照组(A组)，其中男19例、女19例，平均年龄(63.4±6.5)岁。选取同期该院住院的单纯糖尿病患者43例(UACR<30 mg/g)作为糖尿病对照组(B组)，其中男24例、女19例，平均年龄(63.8±7.0)岁。DN患者根据清晨中段尿标本清蛋白/肌酐比值(UACR)分为2组：糖尿病微量清蛋白尿组(C组，38例，UACR 30～300 mg/g)、糖尿病大量清蛋白尿组(D组，39例，UACR>300 mg/g)。纳入标准：均符合世界卫生组织1999年颁布的糖尿病诊断标准[8]和中国2型糖尿病防治指南(2017版)[9]相关标准。排除标准：(1)妊娠、哺乳期女性；(2)活动性感染；(3)心功能Ⅲ级及以上；(4)糖尿病急性并发症：糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高血糖高渗状态、糖尿病乳酸酸中毒；(5)各种原发性及继发性肾脏疾病；(6)肿瘤；(7)泌尿系统炎症、结石；(8)血液系统疾病、自身免疫性疾病；(9)丙氨酸氨基转移酶与天门冬氨酸氨基转移酶比值>2；(10)血糖、血压控制不佳。

1.2仪器与试剂 台式离心机、全自动生化分析仪购自美国Beckman Coulter公司；酶标仪购自中国Rayto公司；KIM-1 ELISA试剂盒和NGAL ELISA试剂盒均购自英国Abcam公司；ZAG ELISA试剂盒购自美国RD公司。

1.3方法 所有受试者在生活饮食规律的情况下，收集24 h尿液，严格按无菌和防腐原则留取，混匀后取5 mL，于-80 ℃冰箱保存；空腹抽取静脉血5 mL， 1 500 r/min 离心10 min，取上清液，于-80 ℃冰箱保存。待收集完毕后，统一检测。

2 结 果

2.1各组一般资料比较 与A组比较，B组、C组、D组的年龄、体质量、体质量指数(BMI)、收缩压、舒张压差异均无统计学意义(P>0.05)；空腹血糖(FBG)、HbA1c水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。B组、C组、D组各组间年龄、体质量、BMI、病程、收缩压、舒张压、FBG、HbA1c比较，差异均无统计学意义(P>0.05)； mAlb、UACR、eGFR及肌酐水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2各组KIM-1、NGAL和ZAG水平比较 结果显示，与A组比较，B组、C组、D组KIM-1、NGAL及ZAG水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。并且DN患者KIM-1、NGAL、ZAG的水平随着患者肾损伤程度的加重而升高。见图1。

2.3DN患者尿液中KIM-1、NGAL和ZAG与临床指标之间的关系 结果显示，DN患者KIM-1水平与UACR(r=0.782，P<0.05)、mAlb(r=0.789，P<0.05)、NGAL(r=0.834，P<0.05)、ZAG(r=0.874，P<0.05)及糖尿病病程(r=0.699，P<0.05)呈正相关，而与eGFR(r=-0.706，P<0.05)呈负相关。DN患者NGAL水平与UACR(r=0.906，P<0.05)、mAlb(r=0.753，P<0.05)、ZAG(r=0.888，P<0.05)及糖尿病病程(r=0.691，P<0.05)呈正相关，而与eGFR(r=-0.668，P<0.05)呈负相关。DN患者ZAG水平与UACR(r=0.888，P<0.05)、mAlb(r=0.717，P<0.05)及糖尿病病程(r=0.673，P<0.05)呈正相关，而与eGFR(r=-0.711，P<0.05)呈负相关。

2.4KIM-1、NGAL和ZAG单独或联合用于DN患者肾功能损伤的诊断效能 KIM-1、NGAL、ZAG指标联合诊断AUC为0.869，特异度为0.862，灵敏度为0.765，均高于某1项指标单独诊断，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 各组一般资料比较

注：A组为KIM-1水平；B组为NGAL水平；C组为ZAG水平；a为P<0.05。

表2 KIM-1、NGAL和ZAG单独或联合用于DN患者肾功能损害的诊断效能

3 讨 论

DN早期临床表现缺少特异性，病程多进展至不可逆阶段才被发现，早期肾损伤的诊断预测和防治是控制和降低其危害的一个重要途径。目前，血清和尿液中ZAG、KIM-1及NGAL应用于肾功能损伤的诊断或者预后均有报道[5-7]，但3项指标联合检测用于诊断DN的报道较少。本研究评估了ZAG、KIM-1及NGAL 3项指标在DN患者尿液中的表达情况，为这些指标用于临床DN的诊断提供更多的数据支持，同时，本研究比较了3项指标联合检测用于早期诊断DN的临床价值，期望为DN的早期诊断提供更为准确和无创的方法。

KIM-1是一种1型上皮膜糖蛋白，表达于近端小管细胞的膜尖上，在炎症、纤维化和肾小管损伤中高表达。研究表明，KIM-1的水平在急性肾损伤的小鼠模型的尿液中升高，并且在尿肌酐水平发生改变之前就能检测到KIM-1的变化[10]。另一方面，在DN患者中尿NGAL水平升高与终末期肾脏病进展相关，并且尿液中高水平的NGAL与血清肌酐水平升高及eGFR水平降低相关[11]。此外，ZAG被认为可以通过旁分泌或自分泌等途径影响瘦素等水平的表达，从而参与肥胖和胰岛素抵抗[12]。有研究发现DN患者尿液中ZAG水平高于健康人群，且ZAG可先于mAlb被检测到，表明ZAG是早期诊断DN的可靠标志物[13]。

本研究结果表明，尿液中的ZAG、KIM-1及NGAL在DN患者中的水平均高于体检健康者，并随着病程的进展而升高。DN患者尿液中ZAG、KIM-1及NGAL的水平均与常规反映肾功能损伤的指标：UACR、mAlb、糖尿病病程及eGFR相关。研究发现肾小管细胞损伤导致吸附过程受阻，随之代偿性引起管状产物增加，并导致KIM-1水平升高[14]。这表明KIM-1可以预测早期肾损伤。另一方面，DE-CARVALHO等[15]和SATIRAPOJ等[16]均发现DN患者尿液和血清中KIM-1的水平随着UACR水平的升高而升高，并且高于健康人群，结果与本研究较一致，表明尿液中KIM-1的水平可作为诊断早期DN的标志物。在NGAL的研究方面，本研究发现尿液中 NGAL在DN患者尿液中的水平均高于体检健康者，并且随着患者肾损伤的发生和发展而升高。GARG等[17]研究发现，糖尿病伴有微量尿清蛋白的患者尿液中NGAL平均水平高于糖尿病不伴有微量尿清蛋白患者，结果与本研究一致，说明NGAL可作为诊断DN的指标。另外，LIM等[18]和ELHEFNAWY等[13]均发现ZAG的水平在DN患者中高于体检健康者，并且ZAG可先于mAlb被检测到，证明ZAG可作为预测早期DN的标志物。这些报道与本研究的结果一致，证明ZAG的检测可预判早期DN。

以上结果表明DN患者尿液中ZAG、KIM-1及NGAL均可作为DN的诊断标志物。由于单一指标容易受到一些与指标相关特定因素的影响，因此，利用单一指标来诊断疾病存在诸多不足之处。基于此，本研究探讨了尿KIM-1、NGAL和ZAG联合检测诊断DN的价值。ROC曲线结果显示，3项指标联合检测的诊断效能均优于某1项指标单独检测。这可能是三者都在肾小管细胞表面高表达，而肾脏发生损伤时，肾小管最先损伤导致。多指标的联合检测显示了较为优越的临床诊断评估价值，因此，多指标联合检测用于疾病的诊断在临床上的应用将更为广泛。

综上所述，DN患者尿液中ZAG、KIM-1及NGAL的水平均高于体检健康者，且上述指标水平随着患者肾损伤的发展而升高；DN患者尿液中ZAG、KIM-1和NGAL的水平均与UACR、mAlb及糖尿病病程呈正相关，而与eGFR呈负相关；DN患者尿液中ZAG、KIM-1和NGAL的水平在UACR、UmAlb升高前升高，对早期诊断DN有较高的临床价值，而3项指标联合检测用于诊断DN的价值更高。