肝癌细胞HepG2外泌体对其自身生长行为的影响及其机制研究*

阴 迪，王一涵，王奕丹，黄钰雯，刘丽梅，夏 薇

北华大学医学技术学院，吉林吉林 132013

肝癌的发生、转移与肿瘤微环境密切相关。有研究表明，肿瘤细胞可以通过细胞与细胞间的直接接触或者旁分泌的方式影响肿瘤微环境，从而促进肿瘤的形成与发展[1-2]，然而其自身生长调节方式与行为改变模式还不清晰。外泌体是细胞分泌的一类30～100 nm的微小囊泡状结构，内含蛋白成分与核酸成分，已有研究表明，外泌体参与细胞通讯，是细胞间沟通的重要媒介[3]。因此，本研究推测肿瘤细胞的外泌体对肿瘤细胞会存在某种影响。为进一步验证该推测，本研究从细胞实验、核酸分析等角度，探讨了肝癌细胞HepG2外泌体对其自身细胞的增殖、迁移、周期及相关基因转录水平的影响。

1 资料与方法

1.1仪器与试剂 肝癌细胞HepG2购自上海中科院细胞库；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；CD63抗体、CD9抗体均购自美国Abcam公司；HRP-羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、HRP-羊抗鼠IgG、超敏ECL化学发光即用型底物均购自美国Boster公司；Transwell细胞板购自美国Corning公司；DiI红色荧光探针购自中国碧云天公司；碘化丙啶试剂购自德国BioFroxx公司；RNA提取与反转录试剂盒、SYBR Green试剂均购自日本Takara公司；实时荧光定量PCR(qPCR)仪、超速离心机均购自美国Thermo公司；透射电子显微镜购自日本Hitachi公司；纳米粒度仪购自美国Microtrac公司；垂直板电泳系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

高压氧治疗可有效提高血氧含量和血氧弥散半径，提高脑组织细胞氧供应和利用，维持脑神经细胞的能量供应，增加对病灶区的供血，使受压萎缩的脑组织血流量增加、脑回体积增大［12］，同时高压氧治疗具有清除自由基作用、减少缺血区脑组织的凋亡，促进脑组织复张；缩小脑组织与颅骨之间的间隙，解除硬膜下血肿的脑微循环障碍及微血管痉挛［13］，改善脑供血不足及升高颅内压，减少内膜再出血，加速胶质细胞的分化增生，避免或减轻外伤后的脑萎缩，促进病变区域毛细血管的再生和侧支循环的建立［14］，明显改善微循环，促进血肿的吸收和神经功能恢复，减少术后积液的发生［15］，有效减少血肿复发率、提高了治愈率。

按照国家相关法律法规和职能划分，口岸出入境货物监管查验工作主要由海关部门负责，进出境货物、人员由检验检疫部门负责的质量和疫情检验工作；进出境人员出入境手续以及违禁品的查验由边检站负责；地方口岸办负责口岸建设管理规划和保障服务工作。[注]引自二连浩特市口岸办：《二连浩特口岸建成成效及困难》，2015年6月24日。权责明确，分工有序。

2) 杨庄东街与晋元庄路交叉口：①原有配时方案中，未考虑晋元庄路东向北右转对南向北直行车辆的影响，造成通行时间浪费；②晋元庄路东向南左转车辆相对较少，给予的绿灯时间过长，造成绿时浪费较为严重.

1.2.1细胞培养 将肝癌细胞HepG2用DMEM培养基培养，加入10%的胎牛血清和1%的青霉素链霉素混合双抗，放至5%CO2、37 ℃、湿度饱和的细胞培养箱培养，待第2天胰酶消化后传代。

1.2.2外泌体的提取 外泌体提取之前，将细胞培养液换成无血清的DMEM培养基处理48 h，收集上清液，用0.22 μm滤器过滤后进行4 ℃差速离心提取[4]，过程如下：将收集好的细胞上清液以3 000 r/min离心30 min，弃沉淀；将上清液转移至聚碳酸酯管中，35 000 r/min离心90 min，弃上清液；加1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗内壁沉淀；转移至1.5 mL小型离心管中，涡旋振荡15 min后，10 000 r/min离心30 min，弃沉淀；将上清液转移至超速离心管中，35 000 r/min离心120 min，弃上清液，加90 μL PBS混匀。

1.2.3外泌体的鉴定 透射电镜拍照：将样品置于铜网上，3%磷钨酸溶液20 μL负染5 min后滤纸吸干，置于透射电镜样品室内观察形态并拍照。粒径检测：先用无菌PBS将参数调零，擦干后加200 μL的外泌体悬液到样品室内，时间设置90 s，3次平行检测液体中粒径大小。蛋白质印迹法(Western blot)检测CD63和CD9两种蛋白：选择10%的分离胶和4%的浓缩胶制备聚丙烯酰胺凝胶电泳，裂解液裂解外泌体蛋白，另裂解细胞总蛋白做阳性对照；将两组样品与4×Loading buffer混合，95 ℃煮样15 min，冷却后上样，上样量为30 μg，浓缩胶以电压80 V电泳，进入分离胶后调整电压为100 V，跑到底部即可停止；采用半干转的方法转膜，阳极到阴极的放置顺序为厚滤纸、聚偏二氟乙烯膜、胶、厚滤纸，25 V转膜15 min；转膜后把膜放在5%的脱脂奶粉中室温摇床封闭3 h，取出膜置于1∶1 000的一抗稀释液中4 ℃摇床过夜，5%脱脂奶粉摇床洗3次，每次10 min；置于1∶4 000的二抗稀释液中室温摇床1 h，5%脱脂奶粉摇床洗5 min，PBS摇床洗2次，每次5 min；按说明书配制发光底物，加入作用底物后用成像系统显影。

1.2.6细胞迁移实验 将细胞无血清培养24 h后，胰酶消化并计数2×104个细胞接种于上室，实验组上室加入100 μL溶有外泌体的DMEM培养基，对照组上室只加入100 μL DMEM培养基。下室均加入含20%胎牛血清的DMEM培养基600 μL。两组平行，分别培养24、48 h后，将上室取出，下室液体弃去，吉姆萨染液染色30 min后PBS冲洗干净，观察并计数细胞数量，镜下拍照，实验平行3次。

1.2.5细胞划痕实验 在24孔板中每孔接种1×104个肝癌细胞HepG2，待细胞长满后，弃上清液，用普通标准黄枪头进行划痕，保持枪头垂直，保证各孔划痕基本一致；用PBS洗去脱落的细胞和漂浮在孔内的细胞碎片；向各孔中加入DMEM培养基，第1孔加入100 μL PBS作为对照组，第2孔加入100 μL的外泌体悬液(0.5 mg/mL)作为实验组，放回培养箱培养；取时间点6、12 h观察细胞分布状态并进行镜下拍照；以划痕面积占图片面积的比例来计算细胞的增殖率，实验平行3次。

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1.2.4肿瘤细胞对自身外泌体的摄取 制备细胞爬片备用，将无菌清洁的小玻片(1 cm×1 cm)放于24孔板中，计数3×104个细胞接种至24孔板，培养细胞至贴壁。使用DiI染料按说明书标记外泌体[5]，使用PBS洗两遍后，超高速离心浓缩外泌体，用DMEM培养基将沉淀重悬备用。第1孔加入100 μL PBS作为对照组，第2孔加入100 μL混有标记好外泌体的DMEM培养基作为实验组。为排除非特异性染色，将最后一遍清洗的PBS上清液取100 μL加入第3孔，培养箱孵育12 h后将24孔板取出，用荧光染核剂Hoechst33258标记细胞核，用多聚甲醛避光固定细胞20 min，PBS洗两遍。三乙烯二胺封片，倒置荧光显微镜观察。

2.2HepG2对荧光标记自身外泌体的摄取 倒置荧光显微镜下观察细胞爬片，并对图片进行融合，结果显示红色小颗粒荧光的外泌体进入了细胞内，围绕于蓝色大颗粒荧光的细胞核周围或核上。收集了最后洗涤的PBS做平行实验，没有发现红色小颗粒荧光信号，说明没有非特异性荧光染色。

2.3肿瘤自身外泌体对细胞增殖的影响 实验组的细胞面积占比高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

经过车牌定位之后，如果成功的话，我们会得到含有车牌的小范围图片。直接对其进行分割处理，往往会出现分割失败的情况。由于诸多不可抗的因素类似于车牌有磨损，车牌表面有泥点，由于光照因素，车牌表面会有反光现象以及最重要的一点，由于拍摄角度问题，车牌会呈现平行四边形或者车牌整体呈现一定的倾斜角度，导致分割时会出现问题[11-14]。当然，车牌本身由于有分隔符以及铆钉等影响，也会出现分割不准确的结果。如果不好好处理，将会影响下一步的识别正确率。因而，在分割之前需要对车牌进行一定的预处理。

表1 基因引物序列及退火温度

2 结 果

2.4肿瘤自身外泌体对细胞迁移的影响 镜下拍照可见24 h和48 h的2个时间点，实验组进入到下室的细胞数量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

注：A为透射电镜观察，标尺长度100 nm；B为Western blot显影图。

1.2.7细胞周期实验 将1×105个细胞接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。实验组每孔加入0.5 mg/mL的外泌体100 μL，对照组每孔加入PBS 100 μL，处理3 d后胰酶消化，1 500 r/min离心5min后加入预冷PBS洗涤2次；加入预冷的70%乙醇4 ℃固定过夜；PBS洗涤1次；加入400 μL碘化丙啶试剂(50 μg/mL)，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，最后用100 μL PBS混匀，用流式细胞仪对细胞周期进行检测，每个样品计数2×104个细胞，结果用细胞周期拟合软件进行分析，实验独立重复3次。

1.2.8引物设计、合成与荧光定量分析 选定细胞周期相关基因细胞周期蛋白(Cyclin D)、细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1(CKS1)，凋亡相关基因B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)进行检测[6-8]。提取0.5 mg/mL外泌体处理的细胞作为实验组，没有外泌体处理的细胞作为对照组。提取两组细胞的RNA进行反转录，再进行qPCR扩增，体系为20 μL，其中上下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，去离子水8.8 μL，SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL。反应程序为95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40个循环。60～95 ℃绘制熔解曲线。内参为β-actin，用2-ΔΔCt法对各基因的相对表达水平进行计算，实验独立重复3次。见表1。

2.1外泌体鉴定结果 透射电镜拍照镜下呈圆形中间凹陷的膜状结构，粒径检测结果显示悬液中粒子大小均在30～100 nm，Western blot成像后显示蛋白CD63和CD9均有条带出现，结果表明外泌体已成功提取，见图1。

2.5肿瘤自身外泌体对细胞周期的影响 对照组的G1、S、G2各期所占比例分别为51.59%，44.33%，2.46%，G2/G1比值为1.81；实验组的G1、S、G2各期所占比例分别为38.30%，43.99%，16.25%，G2/G1比值为1.79。与对照组比较，实验组细胞G1期明显缩短(P<0.05)，S期持平，G2期明显延长，细胞分裂周期缩短。

注：A为划痕6 h和12 h显微镜下视野，标尺长度250 μm；B为划痕6 h和12 h后细胞增殖率，与同时间段对照组比较，aP<0.05，与实验组6 h比较，bP<0.05。

2.6肿瘤自身外泌体对细胞周期、凋亡相关基因相对表达水平的影响 qPCR结果可见，基因Cyclin D、CKS1、Bax在肿瘤自身外泌体的作用下相对表达水平上升，而Bcl-2相对表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为细胞迁移后下室的细胞经过吉姆萨染色后10倍镜下视野；B为细胞迁移后下室的细胞计数情况，与同时间段对照组比较，aP<0.05，与对照组24 h比较，bP<0.05，与对照组48 h比较，cP<0.05。

注：与对照组比较，aP<0.05。

3 讨 论

外泌体是细胞生长代谢过程中分泌出来的一类包含蛋白成分、核酸成分的有膜囊泡状结构。它能够作用于靶细胞，通过其内容物来调控靶细胞的生理状态。本研究对肝癌细胞HepG2的外泌体进行了提取、鉴定，检测了肿瘤细胞对自身外泌体的摄取和吸收，还有其摄取外泌体后的肿瘤细胞的增殖能力和迁移能力，笔者发现肿瘤细胞自身外泌体对肿瘤细胞增殖、迁移等细胞动力学指标均有正向调控趋势。对实验组和对照组进行了细胞周期的检测，结果显示实验组的细胞G1期缩短，G2期延长，说明细胞分裂旺盛，周期正在缩短。对细胞周期调控基因Cyclin D、CKS1和凋亡调控基因Bax、Bcl-2进行相对定量分析，发现两组细胞的CKS1、Cyclin D的相对表达水平都有所上升，所以外泌体很有可能是通过调控CKS1和Cyclin D等细胞周期调控基因的相对表达水平来促使细胞通过G1～S转折期[6]，致使G1期缩短，G2期延长从而缩短细胞周期，达到促进肿瘤细胞生长的作用。而凋亡调控基因Bax相对表达水平上升，由于基因之间复杂的关系，它会抑制Bcl-2的相对表达水平，导致Bcl-2的相对表达水平降低趋近于不转录[9]，所以实验组细胞的凋亡能力会降低从而促进生长。本研究表明，肝癌细胞的细胞周期缩短原因与周期调控类基因相对表达水平上升密切相关，凋亡基因间相互影响而使凋亡受抑制，故增殖能力与迁移能力旺盛。

肿瘤的病程进展与微小RNA(miRNA)密切相关，其中与肝癌相关的miRNA-23、miRNA-139、miRNA-34a等均会影响肿瘤细胞的周期和凋亡情况[10]。miRNA-23和miRNA-139作为肝癌细胞特有的小RNA极有可能被外泌体包裹，从而完成细胞间的信息传递，参与调控细胞的周期和凋亡[11]。在许多肿瘤细胞的外泌体中已经检测到miRNA-34a的存在，并且影响细胞的增殖能力[12]。这些miRNA极有可能以外泌体为载体靶向运输至细胞内，达到调控基因转录的作用。结合本研究分析，肝癌细胞外泌体对其自身来说，起到一定促进生长的作用。这种多基因的调控通常互相影响、十分复杂，需要进一步确定这些基因对于肿瘤发生、发展的生物学作用，从而为疾病的治疗提供更多的指导。

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综上所述，肿瘤自身外泌体可以在体外通过调控Cyclin D和CKS1基因的相对表达水平，缩短肿瘤细胞周期，调控Bax、Bcl-2基因的相对表达水平抑制细胞凋亡，从而使肿瘤细胞增殖更快，迁移能力更强。总体来看，一定水平的肿瘤自身外泌体对肿瘤细胞自身的增殖和迁移能力有促进作用，在以后的实验中还需要进一步明确其对细胞生长的影响，从而为肝癌的临床靶向治疗提供参考。