疑似中枢神经系统感染患者脑脊液病原体多重PCR检测结果的研究*

吴婷娜，王旻晋，钟方财，郭 硕，周妍冰，孟子芮，应斌武△

1．四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041；2．四川省内江市第一人民医院检验科，四川内江 641000

病原体侵入中枢神经系统(CNS)可引起感染性病变[1]，严重时可导致患者死亡。因此，早期、准确地诊断CNS感染是临床治疗的关键。目前，CNS感染的病原体检测主要依靠脑脊液培养、涂片染色和特异性抗原抗体等方法，但检测的灵敏度和时效性较低。

分子生物学诊断技术可以对病原体进行快速、准确的检测，有利于CNS感染病原体的鉴别与诊断。脑膜炎/脑炎多重PCR(MEMP-19)检测技术是将多重PCR扩增和毛细管电泳结合在一起的检测技术，能够针对19种临床常见的CNS感染病原体进行检测。与传统方法比较，有灵敏度、特异度、通量均高的优点[2-4]。本研究利用MEMP-19技术对疑似CNS感染患者的脑脊液病原体进行检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据纳入标准筛选后将拟研究病例分为疑似CNS感染组(A组)与非CNS感染的其他神经系统病变组(B组)，见图1。A组68例，为疑似CNS感染入院治疗的患者，临床表现有疑似CNS感染的症状或体征，如发热、头痛、意识改变等，伴或不伴脑脊液异常，脑脊液白细胞数≥5×106/L，蛋白浓度>0.45 g/L；B组140例，包括颅内占位性病变、自体免疫性脑炎、神经系统退行性病变等临床诊断为非CNS感染性疾病的患者。所有患者入院时间为2019年10-11月。脑脊液标本收集纳入标准：(1)脑脊液标本量≥1 mL，红细胞水平<10×1012/L；(2)脑脊液应在抗菌治疗或免疫制剂治疗前采集；(3)收集患者临床信息。

1.2仪器与试剂 Easy-MAG核酸提取仪及其配套试剂购自上海梅里埃诊断产品有限公司；MEMP-19及其配套试剂购自宁波海尔施基因科技有限公司；ABI3500 Genetic Analyzer、 Applied Biosystems PCR扩增仪均购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.3方法 使用MEMP-19技术对纳入病例的脑脊液标本进行检测，包括19种CNS感染常见病原体：脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌(MTB)、单核细胞增生李斯特菌(LM)、肺炎链球菌、肺炎支原体(MP)、无乳链球菌、流感嗜血杆菌(HI)、大肠杆菌K1、肠道病毒(EVs)、人双埃可病毒、乙型脑炎病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒(HSV)1型、HSV-2、EB病毒(EBV)、人类疱疹病毒6型及新型隐球菌(CN)。分析每种病原体的检出率，并分析患者的单一感染率和混合感染率。

图1 病例纳入流程图

2 结 果

2.1MEMP-19总检出率 208例患者脑脊液标本中有43例检出至少1种病原体，总检出率为20.67%。EBV检出率最高(11.54%)，其次是CN(5.77%)、MTB(3.37%)、EVs(3.37%)及HCMV(1.44%)，HI、HSV-2、LM及MP的检出率均为0.48%。见表1。

表1 208例患者脑脊液标本病原体检出情况(%)

2.2A组、B组检出率情况 A组中有33例至少检出1种病原体，检出率为48.53%。主要是EBV(29.41%)、CN(17.65%)和MTB(10.29%)；B组共检出6例EVs和4例EBV，检出率为7.14%。见表2。

2.3单一感染与混合感染结果 A组的33例阳性标本中，单一感染21例(63.64%)，双重感染10例(30.30%)，三重感染2例(6.06%)。双重感染中，EBV与CN共感染5例、EBV与MTB共感染2例、EBV与HCMV共感染1例、MTB与HCMV共感染1例、EVs与CN共感染1例；三重感染中，EBV、MTB及HCMV共感染1例，EBV、CN及MP共感染1例；B组10例均为单一感染。见表3。

表2 两组脑脊液病原体检出情况(%)

表3 A组单一感染与混合感染的脑脊液病原体分布(n)

2.4A组MEMP-19检测阳性和阴性患者的临床表现及脑脊液指标比较 A组MEMP-19检测阳性和阴性患者在发热、头痛、恶心呕吐、意识改变、抽搐和脑膜刺激征方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，在脑脊液有核细胞计数及脑脊液总蛋白水平比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 A组MEMP-19检测阳性和阴性患者的临床表现及脑脊液指标情况

续表4 A组MEMP-19检测阳性和阴性患者的临床表现及脑脊液指标情况

3 讨 论

CNS感染是一种常见的感染性疾病，起病急、病情重且进展迅速[5]。常规实验室检查或临床症状分析，难以准确诊断CNS感染的病原体。当前，分子生物学诊断技术正快速发展并应用于CNS感染病原体的实验室检测中，但仍存在诸多不足。实时荧光定量PCR可在较短时间内对一种或几种已知病原体进行快速定性检测，但无法用于病原体的高通量筛查；而基于新一代高通量测序技术的病原体检测，可大幅提高对病原体的筛查、检测能力[6]，但其需要专业的检测平台和人员[7]，且价格较为昂贵。本研究首次利用MEMP-19试剂盒对四川大学华西医院208例患者的脑脊液标本进行了病原体检测，在疑似CNS感染组中有48.53%的患者检出病原体，并发现共感染情况。

本研究中A组检出的病原体以EBV(29.41%)和HCMV(4.41%)较为常见，且存在单一感染和共感染并存的情况，这与既往CNS共感染相关研究一致[8-10]。此外，有研究显示，EBV和HCMV是常见的机会性感染病原体[11-12]，可累及多器官系统出现临床症状和持续感染，免疫力低下患者，尤其是合并人类免疫缺陷病毒感染的患者，应考虑EBV和HCMV潜伏感染的可能[13-14]。故仅脑脊液EBV和HCMV检测阳性并不能诊断CNS感染，必须结合临床症状综合考虑。

此外，A组CN检出率为17.65%，12例检出CN的患者中，5例单一感染，7例共感染。CN为条件致病性真菌，是免疫功能低下患者CNS感染常见的病原体[15]，在免疫功能低下患者出现CNS感染症状时，应考虑隐球菌性脑膜炎的可能。

结核性脑膜炎是最严重的肺外MTB感染所致的疾病之一[16]。本研究中A组共检出7例MTB，检出率为10.29%，它们的常规脑脊液培养和抗酸染色检测结果为阴性。由于结核性脑膜炎的非特异性临床表现增加了临床诊疗难度，因此病原学检测对结核性脑膜炎的临床诊断非常重要，而传统的MTB检测主要是抗酸染色镜检及培养，检出率低且培养耗时。因此，MEMP-19检测非常适用于MTB的临床快速筛查和检测。

除此之外，A组还检出HI、LM、MP等病原体，但常规脑脊液培养均为阴性。结合临床症状及随访治疗效果进行分析，确认MEMP-19的检测结果可信。这充分证明了MEMP-19相比传统的实验室检测方法，能够更加准确地对疑似CNS感染病例的脑脊液病原体进行检测。结合临床信息进行分析发现，A组MEMP-19阳性和阴性的患者在临床症状和体征，以及脑脊液生化指标方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，这与伊洁等[17]报道的结果一致，提示MEMP-19检测结果与患者的临床表现没有相关性，而可能与感染病原体毒力和机体免疫力有关。

值得注意的是，本研究中B组检出EVs及EBV。研究显示，EVs等嗜神经性病毒可建立CNS持续性感染，如脊髓灰质炎病毒RNA在感染数年后仍能在脑脊液中检测到[18]。最近一项研究证明在CNS感染中持续检测到EVs序列与肌萎缩侧索硬化的恶性发展相关[19]。也有报道显示，EBV在其原发感染后即建立终身潜伏感染并潜伏于B淋巴细胞，由此可在无CNS感染临床症状时检测到[20]。因此，临床需重视病原体在CNS中的潜伏感染和引起相关并发症的情况。

本研究显示，MEMP-19对脑脊液病原体有较好的检出效果，其耗时短、特异性强且能同时检测多种病原体，因而可为临床提供早期、快速、可靠并且更加全面的病原学检测结果，可提高CNS感染的临床诊断效能。与传统的病原体检测手段比较，MEMP-19检测CNS感染为实验室诊断提供了新思路。