慢性心力衰竭患者外周血miR-133a的表达水平及其临床意义*

马利辉，孙明霞，郭 娜

河北省邯郸市中心医院急诊外一科，河北邯郸 056009

慢性心力衰竭是多种心血管疾病发展的终末阶段，病理生理特征为心脏舒缩功能减退、心排血量减少并出现乏力、呼吸困难、发绀等临床表现，严重影响患者的日常生活，威胁患者生命安全，需要积极进行防治[1]。目前，关于心力衰竭的发病机制尚未有统一的结论，细胞凋亡、炎性反应、氧化应激等均被证实与心力衰竭有关[2-4]。微小RNA(miRNA)是近年来发现的非编码小分子RNA，多种miRNA在心血管系统中发挥重要的调控作用，参与多个生物学环节。在心肌梗死后心力衰竭大鼠模型中，心肌miR-133a的表达水平明显降低且外源性补充miR-133a能够改善心力衰竭、抑制心肌细胞凋亡[5]，提示miR-133a可能在心力衰竭的发生、发展过程中靶向抑制细胞凋亡，但心力衰竭患者外周血中miR-133a表达水平的变化及其对细胞凋亡的靶向调控作用的报道较少。为此，本研究以慢性心力衰竭患者为研究对象，分析了外周血miR-133a表达水平变化的临床意义，并探讨了miR-133a对凋亡分子的可能靶向作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年3月至2018年12月在本院诊断为慢性心力衰竭的患者54例为心力衰竭组，入组标准：(1)符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》中关于慢性心力衰竭的诊断标准[6]；(2)临床资料完整；(3)均留取外周血及血清标本。排除标准：(1)美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级Ⅰ级；(2)合并肥厚性心肌病、心肌梗死、心源性休克、心脏瓣膜病；(3)合并感染、恶性肿瘤、结缔组织病；(4)合并肝、肾功能异常。另选取同期本院体检健康者50例为对照组。所有入组对象均知情同意并经本院伦理委员会批准。心力衰竭组中男29例，女25例；年龄49～68岁，平均(61.38±12.82)岁；平均体质量指数(22.39±6.82)kg/m2；有吸烟史22例，有饮酒史28例，NYHA Ⅱ级18例，Ⅲ级24例，Ⅳ级12例。对照组中男26例，女24例；年龄43～66岁，平均(56.69±11.83)岁；平均体质量指数(21.93±6.24)kg/m2；有吸烟史20例，有饮酒史25例。两组性别、年龄、体质量指数等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 血液RNA提取试剂盒(型号DP419)、miRNA cDNA第一链合成试剂盒(型号KR201)、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒(型号FP401)均购自北京天根公司；B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2，型号F3016)、Bcl-2相关x蛋白(Bax，型号F00152)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3，型号F10010)的酶联免疫吸附测定试剂盒均购自上海西唐公司；7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；680酶标仪购自美国Bio-Rad公司；IU22彩色多普勒超声仪购自荷兰飞利浦公司。

1.3方法

1.3.1外周血miR-133a表达水平的检测 心力衰竭组入院后当天或次日，对照组体检时抽取肘静脉血3 mL，采用血液RNA提取试剂盒分离、提取静脉血中的RNA，采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，采用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒对cDNA中的miR-133a和U6进行荧光定量PCR扩增反应，miR-133a的上游引物序列为5′-ATC GAT CGA TGC TAG CTA T-3′，下游引物为试剂盒通用引物。反应程序如下：95℃预变性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s 重复40个循环。反应完成后在软件中自动生成循环曲线及循环阈值(Ct)，以U6为内参、计算miR-133a的表达水平。

1.3.2血清凋亡分子的检测 心力衰竭组入院后当天或次日，对照组体检时抽取肘静脉血3 mL，静置30 min后3 000 r/min离心20 min，分离上清液后采用酶联免疫吸附测定试剂盒检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的水平，按照试剂盒的说明书进行操作。

1.3.3心力衰竭指标的检测 采用彩色多普勒超声诊断仪进行检查，检查由经验丰富的超声科医生操作，得到超声心动图后计算左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)及左室收缩末期内径(LVESD)。另取血清标本，采用全自动生化分析仪检测脑钠肽(BNP)的水平。

2 结 果

2.1心力衰竭组与对照组外周血miR-133a及血清凋亡分子的比较 心力衰竭组外周血中miR-133a的表达水平及血清中Bcl-2的水平低于对照组，血清中Bax、Caspase-3的水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2心力衰竭组中不同NYHA分级患者外周血miR-133a及血清凋亡分子的比较 心力衰竭组中NYHA Ⅲ级及Ⅳ级患者外周血中miR-133a的表达水平及血清中Bcl-2的水平低于NYHA Ⅱ级患者，血清中Bax、Caspase-3的水平高于NYHA Ⅱ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)，且NYHA IV级患者外周血中miR-133a的表达水平及血清中Bcl-2的水平低于NYHA Ⅲ级患者，血清中Bax、Caspase-3的水平高于NYHA Ⅲ级患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3心力衰竭组与对照组心功能指标的比较 心力衰竭组LVEF低于对照组，LVEDD、LVESD及血清中BNP水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4心力衰竭组患者miR-133a、凋亡分子与心功能指标的相关性 心力衰竭组患者miR-133a、Bcl-2水平与LVEF呈正相关，与LVEDD、LVESD及BNP呈负相关；心力衰竭组患者Bax、Caspase-3与LVEF呈负相关(P<0.05)，与LVEDD、LVESD及BNP水平呈正相关(P<0.05)，见表4。

2.5心力衰竭组患者miR-133a与凋亡分子的相关性 心力衰竭组患者外周血miR-133a的表达水平与血清Bcl-2水平呈正相关(r=0.314，P<0.05)，与血清Bax、Caspase-3水平呈负相关(r=-0.291、-0.241，均P<0.05)。

表1 心力衰竭组与对照组外周血miR-133a及血清凋亡分子的比较

表2 心力衰竭组中不同NYHA分级患者外周血miR-133a及血清凋亡分子的比较

表3 心力衰竭组与对照组心功能指标的比较

表4 心力衰竭组患者miR-133a、凋亡分子与心功能指标的相关性

3 讨 论

慢性心力衰竭的发病机制复杂且未完全阐明，与心力衰竭发病相关的因素包括细胞凋亡、炎性反应、氧化应激、胶原增生、心肌重构等[7-8]。近年来，miRNA在心血管系统中的调控作用受到了越来越多的关注，其中miR-133a是一种具有抗凋亡作用的miRNA。在心肌缺血再灌注、扩张型心肌病、糖尿病心肌病中，miR-133a表达水平的降低均被证实与疾病的加重、心功能的减退有关[9-11]。有研究表明，心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌miR-133a表达水平明显降低、心肌细胞凋亡增加，而外源性补充miR-133a能够抑制心肌细胞凋亡[5]，提示miR-133a可能参与心力衰竭的发生、发展。为了验证miR-133a在心力衰竭发生、发展中的作用，本研究首先分析了心力衰竭患者外周血中miR-133a表达水平的变化，心力衰竭组患者外周血miR-133a的表达水平低于对照组，说明心力衰竭患者miR-133a表达水平降低，与心肌梗死后心力衰竭大鼠中miR-133a的水平变化趋势一致，进而表明miR-133a表达水平的降低与心力衰竭的发生有关。

在心力衰竭的病情发展过程中，会逐步出现心肌收缩力不足、心脏射血量减少、心腔扩大及肺循环淤血等症状；心腔的扩大会牵拉心肌细胞并刺激BNP释放增多。研究表明，心力衰竭患者的LVEF明显降低，LVEDD、LVESD，以及BNP水平明显升高且与心力衰竭的病情存在相关性[12-14]。本研究对慢性心力衰竭患者上述心功能指标的分析结果，与已有研究的报道一致，心力衰竭组患者的LVEF低于对照组，LVEDD、LVESD，以及BNP水平高于对照组。在此基础上进一步分析miR-133a与心力衰竭病情的关系可知：心力衰竭患者的NYHA分级越高，miR-133a的表达水平越低，且miR-133a的表达水平与LVEF呈正相关，与LVEDD、LVESD及BNP呈负相关。说明miR-133a的水平降低与心力衰竭病情的加重有关，进而表明miR-133a表达水平的降低不仅与心力衰竭发生有关，还与心力衰竭病情的进展有关。

miRNA是一类非编码小分子RNA，本身不具备编码蛋白质的功能，其生物学作用的实现依赖于对下游多种靶基因表达的调控。在心肌梗死后心力衰竭大鼠模型中，miR-133a能够靶向调控心肌细胞中线粒体凋亡基因Bax、Caspase-3的表达水平并抑制心肌细胞凋亡的发生[5]；另也有研究证实，上调miR-133a的表达水平能够抑制离体培养的心肌细胞在缺血、缺氧条件下的凋亡[15]；在心肌成纤维细胞中，miR-133a能够直接抑制Bcl-2的表达水平[16]。线粒体凋亡途径受到Bcl-2和Bax的调控，前者能够抑制凋亡，后者能够促进凋亡，最终通过调控Caspase-3的表达和活化影响细胞凋亡[17-18]。心力衰竭患者在接受治疗后，血清中促凋亡分子Bax、Caspase-3的水平明显降低[19]。本研究对心力衰竭患者血清中凋亡分子的分析证实：心力衰竭组患者血清中Bcl-2的水平低于对照组，Bax、Caspase-3的水平高于对照组、且患者NYHA分级越高，Bcl-2的水平越低，Bax、Caspase-3的水平越高，说明线粒体凋亡途径参与了心力衰竭的发生、发展。进一步分析心力衰竭患者miR-133a与凋亡分子的相关性，结果表明miR-133a与Bcl-2呈正相关，与Bax、Caspase-3呈负相关。结合miR-133a在动物实验及细胞中对凋亡的靶向抑制作用推测，心力衰竭发生过程中，miR-133a的表达水平降低可能使其靶向抑制细胞凋亡的作用减弱，继而引起细胞凋亡过度激活并参与病情发展变化。

综上所述，慢性心力衰竭患者外周血miR-133a表达水平降低，与NYHA分级、心功能变化有关，靶向凋亡分子可能是miR-133a发挥作用的途径，miR-133a表达水平的监测可作为评价心力衰竭病情的标志物，治疗心力衰竭的靶点。在今后的研究中，还应进一步收集心力衰竭早期的患者，以发现心力衰竭的预测因子及早期干预靶点。